Μελέτη της ετερόλογης έκφρασης της α-συνουκλεΐνης στον ζυμομύκητα και της αλληλεπίδρασής της με ενδογενείς μεταβολικούς παράγοντες

Abstract

A-synuclein is a protein of 140 amino acids, which is encoded by the gene SNCA and expressed mainly in the presynaptic terminal of the dopaminergic neurons of the substancia nigra pars compacta in the basal ganglia of the human brain. Its accumulation in the internal of the neurons results in their degeneration and the manifestation of Parkinson’s disease. Saccharomyces cerevisiae is used in modeling human diseases, especially neurodegenerative disorders because of the high conservation of essential mechanisms in the sub-cellular level between yeast and neurons. The aim of this dissertation was to establish a model of Parkinson's disease by transferring α-synuclein gene forms to Saccharomyces cerevisiae and the subsequent study of α-synuclein interaction with yeast metabolic pathways implicated in the trehalose biosynthesis and factors that the latter regulates. Trehalose is a non-reducing disaccharide which is found in a plethora of organisms in the nature, including yeasts. It is characterized by its ability to maintain proteins in the right folded formation and inhibit the formation of protein aggregates, while assisting in the confrontation of many kinds of cell stress. In the results of this work all available forms of α-synuclein genes were transferred in yeast cells and their expression was confirmed and it has been shown that the protein is not a toxic agent for yeast in the first 24 hours of its life, whereas toxic phenotypes replicated reliably either by the exogenous use of 1,4-dithiothreitol (DTT) or by yeast cell chronological aging in combination with the expression of α-synuclein. During the viability studies, the high external osmolarity (HEO) condition in the cells was carried out in order to increase the life span of the yeasts in chronological aging and the treatment favored cell viability in the presence as well as in the absence of SNCA. Afterwards, a gradual increase in α-synuclein expression levels in the four cell growth phases was confirmed, where only initial accumulation of α-synuclein was observed in the chronological aging phenotype. Under these observations, gene expression studies were taken place and as resulted of these experiments, in the chronological aging phase, suppression phenomena from the expression of α-synuclein in the transcriptional levels of trehalose’s synthase were observed, although the stimulus for the production of trehalose was increased. In addition, decreased transcriptionals levels in the mechanism of autophagy were detected by the continuous and increasing expression of SNCA. Subsequently, the studies were extended to mutant strains of S. cerevisiae for the three studied trehalose metabolism genes, tps1Δ, tps2Δ and ts11Δ. In tps1Δ, trehalose biosynthesis is impossible and throughout the study it has shown toxicity to the presence of α-synuclein with elevated levels of SNCA expression, decreased viability, particularly in chronological aging, and cytoplasmic aggregates from the exponential growth phase. Gene expression studies revealed elevated expression levels of some of the studied genes in the exponential phase as a response to stress and suppressed expression levels in the distal growth phases indicating the toxic ending of the cells. These indications showed that the HEO condition was unable to improve the viability of the cells in the absence of trehalose synthase. Respectively for tps2Δ cells, which do not biosynthesize trehalose phosphatase and accumulate 6-phospho-trehalose as a by-product, the viability studies in the presence of α-synuclein showed significant suppression and toxic effects in stable expression of the protein in all growth phases, while a global appearance of cytoplasmic inclusions was observed in all growth phases, highlighting the most toxic phenomenon. Furthemore, a generalized suppression of the expression in most of the studied genes in the presence of α-synuclein was observed, revealing toxic effects on the metabolic profile of the cells and the necessity of phosphatase to fill the HEO condition. Finally, in the tsl1Δ strain, in which the trehalose biosynthesis complex partially lost its sensitivity, the phenomena observed by α-synuclein expression were very mild, without greatly decreasing the viability of the cells, without cytoplasmic aggregates of the protein, but with a fall in SNCA expression in the static phase, which may explain the non-toxic phenotype and the balanced gene expression levels. Additionally, it was noticed that the HEO condition can act without the Tsl1p molecule. With the therapeutic intervention with exogenous trehalose in all of the studied cells in the static phase, cell viability increased and the cytoplasmic inclusion bodies that the cells previously carried degraded. From the gene expression studies it appeared that trehalose triggered transcriptionally the autophagy mechanism in wild-type cells, but this was impossible to take place in tps1Δ cells, noting the importance of trehalose synthase as a molecule necessary for the transcriptional activation of the autophagy mechanism. The last step of the present study was the investigation of α-synuclein protein interactions with yeast proteins. For this purpose, a chimeric α-synuclein that had been overexpressed, was interfaced with total protein lysates from wild type yeast cells and tps1Δ mutant cells. The molecule identified primarily to interact with α-synuclein was glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) and secondarily fructose diphosphate aldolase. These proteins appear to play important roles in many cellular pathways of S. cerevisiae cells.

Η α-συνουκλεΐνη αποτελεί μία πρωτεΐνη 140 αμινοξέων η οποία κωδικοποιείται από το γονίδιο SNCA και εκφράζεται κυρίως στο προσυναπτικό άκρο των ντομαπινεργικών νευρώνων της συμπαγούς μοίρας της μέλαινας ουσίας των βασικών γαγγλίων του ανθρώπινου εγκεφάλου. Η συσσώρευσή της στο εσωτερικό των νευρώνων οδηγεί στην εκφύλισή τους με αποτέλεσμα την εκδήλωση της νόσου Parkinson. Ο Saccharomyces cerevisiae χρησιμοποιείται για τη μοντελοποίηση ανθρώπινων νόσων, ειδικότερα νευροεκφυλιστικών διαταραχών, λόγω της υψηλής διατήρησης ουσιωδών μηχανισμών στο υποκυτταρικό επίπεδο μεταξύ νευρώνων και ζυμομύκητα. Στόχο της παρούσας διατριβής αποτέλεσε η εγκατάσταση ενός μοντέλου της νόσου του Parkinson η οποία θα στηριζόταν στη μεταφορά μορφών γονιδίων της α-συνουκλεΐνης στον Saccharomyces cerevisiae. Παράλληλα, επιλέχθηκε η επακόλουθη μελέτη της αλληλεπίδρασης της α-συνουκλεΐνης με μεταβολικά μονοπάτια του ζυμομύκητα που εμπλέκονται στην βιοσύνθεση της τρεχαλόζης και παράγοντες που η παρουσία αυτής ρυθμίζει. Η τρεχαλόζη είναι ένας μη αναγωγικός δισακχαρίτης που απαντάται στους ζυμομύκητες και χαρακτηρίζεται από την ιδιότητά της να διατηρεί τις πρωτεΐνες στην σωστά αναδιπλωμένη τους μορφή και να εμποδίζει το σχηματισμό συσσωματωμάτων, ενώ βοηθά στην αντιμετώπιση πολλών κυτταρικών στρες. Στα αποτελέσματα της διατριβής πραγματοποιήθηκε και τεκμηριώθηκε η μεταφορά και η έκφραση όλων των διαθέσιμων μορφών της α-συνουκλεΐνης στα κύτταρα του ζυμομύκητα και αποδείχθηκε πως η πρωτεΐνη δεν αποτελεί ανασταλτικό παράγοντα για τον ζυμομύκητα στις πρώτες 24 ώρες της ανάπτυξής του, ενώ οι τοξικές επιδράσεις της εμφανίζονται είτε σε συνδυασμό με την εξωγενή παροχή 1,4-διθειο-θρεϊτόλης (DTT) είτε κατά την χρονολογική γήρανση των κυττάρων Saccharomyces cerevisiae που την εκφράζουν. Κατά τη μελέτη της βιωσιμότητας εφαρμόσθηκε η συνθήκη υψηλής εξωτερικής οσμωτικότητας (ΗΕΟ) στα κύτταρα με σκοπό να αυξηθεί το εύρος ζωής των ζυμομυκήτων στην χρονολογική γήρανση και αποδείχθηκε πως η συνθήκη ευνόησε την βιωσιμότητα των κυττάρων παρουσία και απουσία του SNCA. Ακολούθως, διαπιστώθηκε η βαθμιαία αύξηση των επιπέδων έκφρασης της α-συνουκλεΐνης στις τέσσερις φάσεις ανάπτυξης των κυττάρων, όπου παρατηρήθηκε μόνο αρχόμενη συσσώρευση της α-συνουκλεΐνης στον φαινότυπο της χρονολογικής γήρανσης. Στο πλαίσιο αυτό μέσω μελετών της γονιδιακής έκφρασης στην φάση της χρονολογικής γήρανσης διαπιστώθηκαν κατασταλτικά φαινόμενα από την έκφραση της α-συνουκλεΐνης στα μεταγραφικά επίπεδα της συνθάσης της τρεχαλόζης, παρότι το ερέθισμα για την παραγωγή τρεχαλόζης φερόταν αυξημένο. Ακόμη, ανιχνεύτηκαν κατεσταλμένα μεταγραφικά επίπεδα στο σκέλος της αυτοφαγίας από την συνεχόμενη και αυξανόμενη έκφραση του SNCA. Στην συνέχεια, οι μελέτες επεκτάθηκαν σε μεταλλαγμένα στελέχη S. cerevisiae ως προς τα τρία μελετώμενα γονίδια του μεταβολισμού της τρεχαλόζης, τα tps1Δ, tps2Δ και tsl1Δ. Στο tps1Δ είναι αδύνατη η βιοσύνθεση τρεχαλόζης και εμφάνισε καθ’ όλη την διάρκεια της μελέτης του τοξικότητα στην παρουσία της α-συνουκλεΐνης με αυξημένα επίπεδα έκφρασης του SNCA, μειωμένη βιωσιμότητα κυρίως στην χρονολογική γήρανση και κυτταροπλασματικά συσσωματώματα από την εκθετική φάση ανάπτυξης. Οι μελέτες γονιδιακής έκφρασης ανέδειξαν ένα προφίλ απόκρισης στο στρες από την εκθετική φάση και κατεσταλμένα επίπεδα έκφρασης στις απώτερες φάσεις ανάπτυξης μαρτυρώντας την τοξική κατάληξη των κυττάρων, οπότε φάνηκε πως η συνθήκη ΗΕΟ αδυνατούσε να βελτιώσει την βιωσιμότητα των κυττάρων απουσία της συνθάσης της τρεχαλόζης. Αντίστοιχα για τα κύτταρα tps2Δ, τα οποία δεν βιοσυνθέτουν φωσφατάση της τρεχαλόζης και συσσωρεύουν 6-φωσφο-τρεχαλόζη ως παραπροϊόν, οι μελέτες βιωσιμότητας παρουσία της α-συνουκλεΐνης έδειξαν σημαντική καταστολή και τοξικά φαινόμενα σε σταθερή έκφραση της πρωτεΐνης σε όλες τις φάσεις ανάπτυξης, ενώ παρατηρήθηκε καθολική εμφάνιση κυτταροπλασματικών εγκλείστων σε όλες τις φάσεις ανάπτυξης, αναδεικνύοντας τον πιο τοξικό φαινότυπο μεταξύ αυτών που διερευνήθηκαν. Ακόμη, διαπιστώθηκε μια γενικευμένη καταστολή της έκφρασης των περισσοτέρων μελετώμενων γονιδίων παρουσία της α-συνουκλεΐνης, αναδεικνύοντας τοξικά φαινόμενα στο μεταβολικό προφίλ των κυττάρων και την αναγκαιότητα της φωσφατάσης για την πλήρωση της συνθήκης ΗΕΟ. Τέλος, στο στέλεχος tsl1Δ, στο οποίο το σύμπλοκο βιοσύνθεσης της τρεχαλόζης έχει απωλέσει μερικώς την ρυθμιστική ευαισθησία του, τα φαινόμενα που παρατηρήθηκαν από την έκφραση της α-συνουκλεΐνης ήταν πολύ ήπια, χωρίς μεγάλη πτώση της βιωσιμότητας των κυττάρων, χωρίς κυτταροπλασματικά συσσωματώματα της πρωτεΐνης, αλλά με πτώση της έκφρασης του SNCA στην στατική φάση, γεγονός που μπορεί να ερμηνεύει τον μη τοξικό φαινότυπο και τα εξισορροπημένα επίπεδα γονιδιακής έκφρασης που παρατηρήθηκαν. Επίσης, φάνηκε πως η δράση της συνθήκης ΗΕΟ δεν επηρεάζεται από την απουσία του Tsl1p. Με την δοκιμή της θεραπείας όλων των κυττάρων με χορήγηση εξωγενούς τρεχαλόζης στη στατική φάση ανάπτυξης παρατηρήθηκε ότι με αυτή την παρέμβαση η βιωσιμότητα των κυττάρων αυξήθηκε, ενώ δεν παρατηρήθηκαν κυτταροπλασματικά έγκλειστα στα κύτταρα που προηγουμένως τα έφεραν. Από τις μελέτες γονιδιακής έκφρασης φάνηκε πως η τρεχαλόζη ενεργοποίησε μεταγραφικά τον μηχανισμό της αυτοφαγίας στα κύτταρα αγρίου τύπου, αλλά αυτό δεν συνέβη στα κύτταρα tps1Δ, γεγονός που υποδηλώνει την σημαντικότητα της συνθάσης της τρεχαλόζης ως μόριο απαραίτητο για την μεταγραφική ενεργοποίηση του αυτοφαγικού μηχανισμού. Τέλος, διερευνήθηκε η αλληλεπίδραση της α-συνουκλεΐνης με πρωτεΐνες του ζυμομύκητα. Για το σκοπό αυτό υπερεκφράστηκε μία χιμαιρική α-συνουκλεΐνη που υπεβλήθη σε αλληλεπίδραση με ολικά πρωτεϊνικά εκχυλίσματα των αγρίου τύπου κυττάρων και των μεταλλαγμένων κυττάρων tps1Δ. Το μόριο που ταυτοποιήθηκε κατ’ εξοχήν να αλληλεπιδρά με την α-συνουκλεΐνη ήταν η αφυδρογονάση της 3-φωσφορικής γλυκεραλδεΰδης (GAPDH) και δευτερευόντος η αλδολάση της διφωσφορικής φρουκτόζης. Οι πρωτεΐνες αυτές φαίνεται να παίζουν σημαντικό ρόλο σε πολλά κυτταρικά μονοπάτια των κυττάρων S. cerevisiae.