Μελέτη διαγονιδιακών μυών που εκφράζουν την αγρίου τύπου hGDH2 (WT-hGDH2)

Abstract

Mammalian glutamate dehydrogenase 1 (GDH1) is a mitochondrial enzyme that catalyzes the reversible oxidative deamination of glutamate to α-ketoglutarate and ammonia using NAD+/NADP+ as cofactor .It links amino acid with carbohydrate metabolism, contributing to Krebs cycle anaplerosis, energy production, ammonia handling and redox homeostasis. While most mammals possess a single GDH1 protein (hGDH1 in the human) that is highly expressed in the liver, humans and other primates have acquired, via duplication, an hGDH2 isoenzyme with distinct functional properties and tissue expression profile. The novel hGDH2 underwent rapid evolutionary adaptation, acquiring unique properties that enable enhanced enzyme function under conditions inhibitory to its ancestor hGDH1. These are though to provide a biological advantage to humans with hGDH2 evolution occurring concomitantly with human brain development. hGDH2 is co-expressed with hGDH1 in human brain, kidney, testis and steroidogenic organs, but not in liver.To better understand the role of hGDH2 in human biology, we generated a transgenic mouse model expressing hGDH2 by inserting a human DNA segment containing the GLUD2 gene and it regulatory elements into their genome. Study of the GLUD2 Tg mice brain using double IF and confocal microscopy, revealed a hGDH2 cellular expression pattern similar to that observed in human brain. These observations provided credence to the hypothesis that, by finding a suitable promoter in the X chromosome, the duplicated GLUD2 gene diversified its roles in human tissues.In light of these considerations, we explored the hGDH2 expression in non-neural organs (including pancreatic tissue) of Tg mice and the effect of GLUD2 gene on glucose homeostasis. Using specific antibodies we observed that hGDH2 is co-expressed with the endogenous murine GDH1 in pancreatic β-cells of Tg mice. Fasting blood glucose (FBG) levels were lower and of a narrower range in Tg (95% CI: 90.6-96.8 mg/dL; N=26) than in WT (95% CI: 136.2-151.4 mg/dL; N=23; p<0.0001), closely resembling those of healthy humans. GLUD2 also protected the host mouse from developing diabetes with advancing age. Tg animals maintained 2.6-fold higher fasting serum insulin levels (mean±SD: 1.63±0.15 ng/ml; N=12) than Wt mice (0.63±0.05 ng/ml; N=12; p b 0.0001). Glucose loading (1 mg/g, given i.p.) induced comparable serum insulin increases in Tg and Wt mice, suggesting no significant GLUD2 effect on glucose-stimulated insulin release.L-leucine (0.25 mg/g given orally) induced a 2-fold increase in the serum insulin of the Wt mice, implying significant activation of the endogenous GDH1. However, L-leucine had little effect on the high insulin levels of the Tg mice, suggesting that, under the high ADP levels that prevail in β-cells in the fasting state, glutamate flux through hGDH2 is close to maximal. Hence, the present data, showing that GLUD2 expression in Tg mice improves in vivo glucose homeostasis by boosting fasting serum insulin levels, suggest that evolutionary adaptation of hGDH2 has enabled humans to achieve narrow-range euglycemia by regulating glutamate-mediated basal insulin secretion.

Η γλουταμική αφυδρογονάση των θηλαστικών είναι ένα μιτοχονδριακό ένζυμο που καταλύει την αντιστρεπτή οξειδωτική απαμίνωση του γλουταμικού σε α-κετογλουταρικό και αμμωνία, χρησιμοποιώντας ως συνένζυμο το NAD+/NADP+. Απαντάται σε όλους τους οργανισμούς και έχει σημαντικό ρόλο στον μεταβολισμό, τόσο σε καταβολικές όσο και σε αναβολικές βιοσυνθετικές διεργασίες. Σε αντίθεση με τα περισσότερα είδη θηλαστικών που διαθέτουν μία GDH (hGDH1 στον άνθρωπο) που εκφράζεται σε όλους του ιστούς, ο άνθρωπος και κάποια πρωτεύοντα έχουν αποκτήσει, μέσω ρετρομετάθεσης του GLUD1 γονιδίου στο χρωμόσωμα Χ, ένα δεύτερο ισοένζυμο (hGDH2) με διαφορετικό μηχανισμό ρύθμισης και ιστο-ειδική έκφραση. Το γονίδιο της GLUD2 εξελίχθηκε ταχέως υπό την πίεση της φυσικής επιλογής και απέκτησε μία σειρά από αμινοξικές αλλαγές, επιτρέποντας στην hGDH2 να λειτουργεί σε συνθήκες ανασταλτικές για την hGDH1. Οι μοναδικές ιδιότητες της hGDH2 θωρείται πως επέτρεψαν την προσαρμογή του ενζύμου στις υψηλές ενεργειακές απαιτήσεις του νευρικού συστήματος και στις ειδικές ανάγκες των άλλων ιστών. Η hGDH2 στον άνθρωπο εκφράζεται, μαζί με την hGDH1, στον ανθρώπινο εγκέφαλο, τους νεφρούς, τους όρχεις και τα στεροειδοπαραγωγά όργανα, αλλά δεν εκφράζεται σε μεγάλο βαθμό στο ήπαρ. Με σκοπό να κατανοήσουμε τον ρόλο της hGDH2 στη βιολογία του ανθρώπινου οργανισμού, δημιουργήσαμε ένα διαγονιδιακό ζωικό πειραματικό μοντέλο μυός που εκφράζει την αγρίου τύπου hGDH2 μαζί με την ενδογενή mGDH. Μελέτες διπλού ανοσοφθορισμού σε τομές περιφερικών ιστών και εγκεφάλου διαγονιδιακών ζώων, αποκάλυψαν πως η διαγονιδιακή hGDH2 πρωτεΐνη παρουσιάζει πρότυπο έκφρασης που δεν διαφοροποιείται από αυτό του ανθρώπου. Με τη χρήση ειδικών αντισωμάτων διαπιστώσαμε ότι η hGDH2 εκφράζεται στα κύτταρα Sertoli του όρχεως των διαγονιδιακών ζώων στα οποία η mGDH απουσιάζει ακριβώς όπως και στον άνθρωπο. Εκφράζεται επίσης μαζί με την ενδογενή mGDH στην πλειονότητα των υπολοίπων περιφερικών ιστών καθώς και στα β-κύτταρα του παγκρέατος των διαγονιδιακών ζώων. Με έναυσμα αυτές τις παρατηρήσεις, μελετήσαμε αν η έκφραση του διαγονιδίου επηρεάζει τον ομοιοστατικό μηχανισμό της γλυκόζης και διαπιστώσαμε πως τα επίπεδα γλυκόζης νηστείας των διαγονιδιακών ζώων ήταν σημαντικά χαμηλότερα έναντι των αγρίου τύπου ζώων (Τg: 95% CI: 90.6-96.8 mg/dL; N=26, WT:95% CI: 136.2-151.4 mg/dL; N=23; p<0.0001), προσεγγίζοντας τις φυσιολογικές τιμές γλυκόζης νηστείας των υγιή ενήλικων ανθρώπων. Τα επίπεδα ινσουλίνης ορού νηστείας των διαγονιδιακών ζώων ήταν 2.6 φορές μεγαλύτερα (mean±SD: 1.63±0.15 ng/ml; N=12) σε σχέση με τα αντίστοιχα επίπεδα των αγρίου τύπου ζώων (0.63±0.05 ng/ml; N=12; p=0.0001). Η αύξηση των επιπέδων ινσουλίνης μετά από φόρτιση με γλυκόζη (1 mg/g,i.p.) ήταν συγκρίσιμη μεταξύ των διαγονιδιακών και αγρίου τύπου ζώων υποδηλώνοντας πως η έκφραση της διαγονιδιακής hGDH2 πρωτεΐνης δεν επηρέασε την γλυκοζο-εξαρτώμενη έκφραση ινσουλίνης. Η φόρτιση με το αμινοξύ L-λευκίνη (0.25 mg/g) είχε ως αποτέλεσμα τον διπλασιασμό των τιμών των επιπέδων ινσουλίνης των αγρίου ζώων, αλλά δεν είχε καμία επίδραση στα ήδη υψηλές τιμές των επιπέδων ινσουλίνης των διαγονιδιακών ζώων, υποδηλώνοντας πως οι υψηλές συγκεντρώσεις του ADP που επικρατούν στα β-κύτταρα σε συνθήκες νηστείας έχουν ως αποτέλεσμα την μέγιστη ενεργοποίηση της hGDH2, οπότε και δεν επιτυγχάνεται περαιτέρω ενεργοποίηση παρά την προσθήκη ενός αλλοστερικού ενεργοποιητή. Παράλληλα η ύπαρξη του GLUD2 διαγονιδίου φαίνεται να προστατεύει τα διαγονιδιακά ζώα από την ανάπτυξη διαβήτη και παχυσαρκίας με το γήρας. Η έκφραση της hGDH2 στον εγκέφαλο ήταν παρόμοια με εκείνη που παρατηρείται στον άνθρωπο. Η διαγονιδιακή πρωτεΐνη ανιχνεύθηκε στα αστροκύτταρα κατά μήκος των αποφυάδων τους και των ποδίσκων τους γύρω από τα αγγεία, σε ένα υποσύνολο νευρώνων με πυραμιδική μορφολογία και κυρίως στο νευροπίλημα. Σε αντίθεση με τον άνθρωπο, διαπιστώθηκε έκφραση της hGDH2 στα ολιγοδενδροκύτταρα. Τα αποτελέσματα των συμπεριφορικών μελετών δεν ανέδειξαν σημαντικές διαφορές στις δοκιμασίες κινητικότητας και χωρικής ή αναγνωριστικής μνήμης. Εντούτοις, τα διαγονιδιακά ζώα εμφάνιζαν σημαντικά μεγαλύτερη ευαισθησία στον πόνο και αυξημένα επίπεδα άγχους. Η λεπτή μορφολογική μελέτη του εγκεφάλου με τη χρώση Golgi-Cox, αποκάλυψε πως η έκφραση της διαγονιδιακής πρωτεΐνης στον εγκέφαλο των διαγονιδιακών ζώων σχετίζεται με αυξημένο αριθμό ώριμων δενδριτικών ακάνθων στον ιππόκαμπο και τον προμετωπιαίο λοβό, περιοχές με πλούσια γλουταματεργική νευροδιαβίβαση. Συμπερασματικά, το GLUD2 διαγονιδιακό μοντέλο ζώου θα μπορούσε να θεωρηθεί εξανθρωποποιημένο με βάση το πρότυπο έκφρασης του. Η χαρτογράφηση του φαινοτύπου μέχρι στιγμής, υποστηρίζει ότι η hGDH2 έχει εξελιχθεί με τέτοιο τρόπο, ώστε να λειτουργεί συμπληρωματικά της hGDH1 στους ιστούς στους οποίους εκφράζεται, με σκοπό την βέλτιστη εξυπηρέτηση των ειδικών αναγκών του καθενός. Υπό αυτό το πρίσμα, η έκφρασή της στο πάγκρεας είχε ως αποτέλεσμα την διασφάλιση, σε συνθήκες νηστείας, μια μικρού εύρους ευγλυκαιμίας, παρόμοιας με εκείνη του ανθρώπου. Φαίνεται επίσης να ασκεί προστατευτική δράση απέναντι στην ανάπτυξη διαβήτη και παχυσαρκίας κατά το γήρας. Τα πρώτα δεδομένα της επίδρασης της έκφρασης του διαγονιδίου στο κεντρικό νευρικό σύστημα υποδηλώνουν ότι η παρουσία του διαγονιδίου οδήγησε σε αύξηση των ώριμων δενδριτικών ακάνθων σε περιοχές με πλούσια γλουταματεργική νευροδιαβίβαση όπως ο ιππόκαμπος και ο προμετωπιαίος λοβός. Αν αυτό σημαίνει ότι αυξήθηκε η συναπτογένεση και μέσω αυτής ενισχύθηκε η γλουταματεργική νευροδιαβίβαση μέσω της οποίας διαμεσολαβούνται οι τόσο εξελιγμένες γνωστικές λειτουργίες του ανθρώπου μένει να αποδειχτεί σε μελλοντικές μελέτες.