Στοχευμένα φάρμακα: ενδοκυττάρωση, διακίνηση και μοριακός μηχανισμός δράσης: ταυτοποίηση και λειτουργικός χαρακτηρισμός ρυθμιστών της αγγειογένεσης σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου που φέρουν μεταλλάξεις στο γονίδιο PIK3CA

Abstract

The deregulation of the PI3K signaling pathway by several mechanisms has a crucial role in colon cancer progression. In 10-30% of colon cancers the oncogene PIK3CA, which encodes the catalytic subunit of PI3Ks (p110α), is mutated and has been studied as an effective molecular target for therapeutic interventions. The most common mutations of the PIK3CA gene in colon cancer are H1047R, in the kinase domain, and E545K, in the helical domain, both of which lead to oncogenic transformation by increasing PI3K activity. The overactivation of PI3K by these mutations regulates growth, survival and also angiogenesis. In the present study, in order to investigate regulators of angiogenesis downstream of PIK3CA the colorectal cancer cell lines DLD1 and HCT116 were used in which the most common mutations of PI3KCA, E545 and H1047R respectively, were inactivated bygene targeting generating isogenic cell lines harbouring either the wild type (WT) or the mutated allele (MUT). We first validated the genotype of the cell lines using a genotyping strategy designed to ensure that the cell lines are correct. We also tested whether the cell lines behave as expected regarding the phosphorylation of AKT on both T308, S473. Microarray analysis of WT and MUT clones in 0.5% serum yeilded 34 differentially regulated genes (18 upregulated, 16 downregulated) in HCT116 cells and 47 genes in DLD1 cells (25 upregulated, 22 downregulated) among which 2 genes were common. Furthermore, the microarray results yielded some candidate genes which, according to the literature, may play a role in angiogenesis. One of the most important genesupregulated in DLD1 MUT cell line is the Chemokine (C-X-C motif) ligand 5 (CXCL5). CXCL5 is a low molecular weight chemotactic chemokine, which binds the G-protein coupled receptor CXCR2 and acts as a proangiogenic agent and a powerful attractant for neutrophils. The levels of secreted CXCL5 by DLD1 MUT cells showed a 3-fold increase compared to DLD1 WT by Western Blot. Also, using a series of AKT1, AKT2 and AKT1/2 knockout DLD1 clones, we demonstrated that the expression of CXCL5 is AKT1 and not AKT2 dependent. To further investigate the effects of CXCL5 in DLD1-MUT cells and in angiogenic responses, in vitro and in vivo, two CXCL5 knockout clones (DLD1-MUT-CXCL5-/-CL7 and DLD1-MUT-CXCL5-/-CL8) of DLD1-MUT cells were generated using the CRISPR/Cas9 Double nickase system. Live cell analysis experiments using the IncuCyte system showed that DLD1-MUT- CXCL5-/- cells exhibit reduced growth and invasion (through Matrigel) compared to DLD1-MUT cells. Also, DLD1-MUT- CXCL5-/- clones showed decreased tumorsphere forming ability in vitro compared to the DLD1-MUT cells, indicating a role of CXCL5 in the regulation of DLD1-MUT cell stemness. Additionally, it was observed that CXCL5 modulates proliferation and tube formation of HUVEC cells in vitro. In vivo experiments were performed by incorporating either DLD1 MUT CXCL5-/- or DLD1 MUT cells into Matrigel plugs. The plugs were injected subcutaneously in mice and tumor volume and angiogenesis was scored. DLD1-MUT-CXCL5-/- cell plugs generated smaller tumors and decreased percentage of CD31 positive vessels with apparent lumen compared to plugs containing DLD1-MUT cells. In conclusion, in this study we show that PIK3CA E545K results in enhanced expression of CXCL5 in an AKT1 dependent manner in DLD1 human colon cancer cells. We also provide evidence that CXCL5 is implicated in tumor proliferation, invasion and angiogenesis.

Ο καρκίνος του παχέος εντέρου αποτελεί έναν από τους συχνότερους τύπους καρκίνου και ευθύνεται για το 10% των θανάτων από καρκίνο. Η απορρύθμιση του σηματοδοτικού μονοπατιού της PI3K αποτελεί ένα κρίσιμο γεγονός στην πρόοδο του καρκίνου του παχέος εντέρου. Το 10-30% των όγκων του παχέος εντέρου εμφανίζει μεταλλάξεις στο ογκογονίδιο PIK3CA, το οποίο κωδικοποιοεί την καταλυτική υπομονάδα της PI3K κλάσης ΙΑ, και το οποίο έχει αποτελέσει έναν υποψήφιο στόχο θεραπευτικών παρεμβάσεων στον καρκίνο. Οι πιο συχνές μεταλλάξεις του PIK3CA στον καρκίνο του παχέος εντέρου είναι η H1047R στην περιοχή ενεργότητας κινάσης και η E545K στην περιοχή έλικας, οι οποίες επάγουν την κακοήθη εξαλλαγή αυξάνοντας την ενζυμική δραστικότητα της PI3K. Η αυξημένη ενεργοποίηση της PI3K μέσω των μεταλλάξεων αυτών ρυθμίζει την κυτταρική ανάπτυξη, την επιβίωση και την αγγειογένεση. Η αγγειογένεση αποτελεί ένα από τα κύρια χαρακτηριστικά των συμπαγών όγκων και επί του παρόντος η αντιαγγειογενετική θεραπεία χρησιμοποιείται στην αντιμετώπιση του καρκίνου του παχέος εντέρου. Παρ’όλα αυτά οι μηχανισμοί μέσω των οποίων η μεταλλαγμένη PI3K ρυθμίζει τη νεοπλασματική αγγειογένεση δεν έχουν διευκρινιστεί. Στην παρούσα μελέτη, με στόχο τη διερεύνηση ρυθμιστών της αγγειογένεσηςκαθοδικά του μεταλλαγμένου PIK3CA, χρησιμοποιήθηκαν οι καρκινικές σειρές του παχέος εντέρου DLD1 και HCT116 στις οποίες οι μεταλλάξεις E545K και H1047R αντίστοιχα, έχουν απενεργοποιηθεί μέσω γονιδιακής στόχευσης. Έτσι προέκυψαν ισογονιδιακές κυτταρικές σειρές οι οποίες εκφράζουν είτε το φυσικού τύπου (WT) είτε το μεταλλαγμένο αλληλόμορφο (MUT). Αρχικά επιβεβαιώθηκε η ορθή γονιδιακή στόχευση των σειρών αυτών μέσω γονοτυπικής ανάλυσης. Επιπλέον ελέγθηκαν και επιβεβαιώθηκαν με βάση τη βιβλιογραφία τα επίπεδα της φωσφορυλίωσης της AKT (στα κατάλοιπα T308 και S473) στις WT και ΜUT. Τα αποτελέσματα της ανάλυσης μικροσυστοιχιών μεταξύ των WT και MUT κυττάρων σε συνθήκες 0.5% ορού, αποκάλυψαν 34 γονίδια με διαφορική έκφραση στα HCT116 κύτταρα (18 με αυξημένη έκφραση, 16 με μειωμένη έκφραση) και 47 γονίδια στα DLD1 κύτταρα (25 με αυξημένη έκφραση, 22 με μειωμένη έκφραση), ενώ 2 από τα γονίδια εντοπίστηκαν και στις δύο σειρές (HCT116 και DLD1). Επιπροσθέτως, μεταξύ των γονιδίων εντοπίστηκαν και κάποια τα οποία με βάση τη βιβλιογραφία είναι μόρια-ρυθμιστές της αγγειογένεσης. Ένα από τα σημαντικότερα γονίδια το οποίο παρουσίασε αυξημένη έκφραση στη DLD1 MUT σειρά ήταν ηχημειοκίνη CXCL5. Η CXCL5 είναι μια μικρού μοριακού βάρους χημειοτακτική κυτταροκίνη, η οποία προσδένεται στον υποδοχέα CXCR2, δρα ως προαγγειογενετικός παράγοντας αλλά και ως κύριος παράγοντας προσέλκυσης ουδετερόφιλων. Η έκκριση της CXCL5 από τα DLD1 MUT κύτταρα ήταν αυξημένη σε σχέση με τα DLD1 WT, όπως αποδείχθηκε μέσω ανοσοαποτύπωσης κατά Western. Επίσης, ο έλεγχος της έκφρασης της CXCL5 σε κυτταρικές σειρές DLD1 στις οποίες τα γονίδια AKT1 ή ΑΚΤ2 ή και τα δύο είχαν αποσιωπηθεί, έδειξε ότι η έκφραση της CXCL5 είναι εξαρτώμενη από την AKT1 και όχι από την AKT2. Με σκοπό τη περαιτέρω διερεύνηση των επιδράσεων της CXCL5 σταDLD1 MUT κύτταρα και σε αγγειογενετικές αποκρίσεις in vitro και in vivo, πραγματοποιήθηκε γονιδιακή αποσιώπηση της CXCL5 στα κύτταρα αυτά μέσω του συστήματος CRISPR Cas9 (dual nickase) διπλής σχάσης/εγκοπής και προέκυψαν 2 θετικοί κλώνοι. Πειράματα με το σύστημα IncuCyte έδειξαν ότι τα DLD1 MUT CXCL5-/- κύτταρα παρουσίασαν μειωμένο ρυθμό αύξησης και μειωμένη δεισδυτική ικανότητα σε Matrigel σε σύγκριση με τα DLD1 MUT. Επίσης, οι κυτταρικοί κλώνοι DLD1 MUT CXCL5-/- εμφάνισαν μειωμένη ικανότητα σχηματισμού καρκινικών σφαιρών(tumorspheres) in vitro σε σχέση με τα DLD1 MUT, αποτέλεσμα που αναδεικνύει το ρόλο της CXCL5 στη ρύθμιση της βλαστικότητας των DLD1 MUT κυττάρων. Επιπροσθέτως, παρατηρήθηκε ότι η CXCL5 ρυθμίζει τον πολλαπλασιασμό και το σχηματισμό αγγειακών δομών από των ενδοθηλιακών κύττάρων HUVEC in vitro. Τέλος πραγματοποιήθηκαν in vivo πειράματα σε ποντίκια στα οποία πραγματοποιήθηκε υποδόρια έγχυση Matrigel αναμεμειγμένου με τα κύτταρα DLD1 MUT ή DLD1 MUT CXCL5-/-. Τα εμφυτεύματα Matrigel με τα DLD1 MUT CXCL5-/- σχημάτισαν μικρότερους όγκους, με CD31-θετικά αγγεία μικρότερης διαμέτρου αυλού σε σχέση με τα εμφυτεύματα των DLD1 MUT κυττάρων. Τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης οδηγούν στο συμπέρασμα ότι ημετάλλαξη E545K του PIK3CA γονιδίου οδηγεί σε αυξημένη έκφραση της χημειοκίνης CXCL5 μέσω της AKT1 σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου. Η εκκρινόμενη CXCL5 επιδρά στο φαινότυπο των καρκινικών κυττάρων του παχέος εντέρου (που φέρουν την E545K μετάλλαξη) αλλά επηρεάζει την αύξηση και την αγγειογένεση όγκων που σχηματίζονται από τα κύτταρα αυτά σε ποντίκια.