Σημασία του βακτηρίου Salmonella enterica subsp. diarizonae στο διαρροϊκό σύνδρομο των αρνιών

Abstract

The present thesis focuses in the study of infection of lambs by Salmonella enterica subsp. diarizonae, by performing work in the field and in an experimental setting. The general objective of the thesis is to increase available knowledge regarding gastrointestinal infections of lambs, particularly caused by S. enterica subsp. diarizonae. Specific objectives of the thesis are as follows: (i) the investigation of the extent of infection of lambs by S. enterica subsp. diarizonae in sheep farms with the clinically evident diarrhoeic syndrome in lambs and (ii) the evaluation of the potential pathogenicity of S. enterica subsp. diarizonae for lambs. The thesis is divided into three chapters followed by the General Discussion. In Chapter I, the relevant literature is reviewed. The Chapter is subdivided into three Parts. In Part A, the literature about the taxonomy and nomenclature of Salmonella is briefly reviewed. In Part B, the literature about Salmonella infections of sheep is presented. In Part C, the literature about the clinical conditions caused by S. enterica subsp. diarizonae in animals is appraised. In Chapter II, after a brief note regarding S. enterica subsp. diarizonae in field studies in sheep farms (Part A), an outbreak of diarrhoeic syndrome in lambs caused by the organism (Part B) and a field investigation of its occurrence in sheep farms in Central Greece (Part C) are presented. An outbreak of diarrhoeic syndrome in lambs was investigated in a sheep farm. Specifically, frequent cases of diarrhoea in 5 to 15-day old lambs were reported by the farmer within a period of 7 days. In total, 25 lambs had been ill with diarrhoea (incidence rate: 0.156). Among these, 10 had already died when the investigation started (case fatality: 0.400). Clinical examination revealed severe diarrhoea in lambs. A detailed post-mortem examination was performed in two lambs, with salient findings being: evidence of inflammation in jejunum and ileum in the small intestine and presence of petechiae in the intestinal wall, which was thinner than normal. From live animals, faecal samples were collected for laboratory investigations by bacteriological, virological and parasitic techniques. The tests revealed only abundant growth of S. enterica in pure culture from small intestine and liver tissue samples. Complete identification of the isolates indicated these as Salmonella enterica subsp. diarizonae 61:k:1,5,(7) isolates. Enrofloxacin was prescribed for administration to lambs. Further faecal samples were collected for up to 42 days post-treatment. The organism was reisolated 22 days after the end of the treatment course. An investigation was performed in 21 sheep farms in central Greece through faecal sample collection from diarrhoeic lambs (n = 119). Samples were processed for potential recovery of Salmonella, using also enrichment techniques. In no case, any Salmonella spp. organism was isolated. In Chapter III, an experimental study regarding the potential role of S. enterica subsp. diarizonae for the diarrhoeic syndrome of lambs is presented (Parts B and C). In total, 12 lambs were challenged with the S. enterica subsp. diarizonae isolate recovered during the field study (Chapter II). The lambs were challenged orally on the first day after birth, with a dose ranging from 0.75 × 109 to 1.80 × 109 c.f.u. Sequential blood samples, faecal samples and buccal swabs were collected at regular intervals after challenge from lambs. Sequential faecal and milk samples were collected from the dams of the lambs. Lambs were sequentially euthanised 1, 2, 4, 7, 10, 14 and 21 days after challenge. Samples were processed by bacteriological techniques for isolation of the challenge organism; they were also subjected to examination by molecular techniques (PCR) for detection of the invA gene. Tissue samples (small intestine, abomasum, liver, gallbladder) harvested from all euthanised lambs were also subjected to bacteriological and molecular examinations and were processed for histopathological examination. Salmonella was isolated from faecal samples of all lambs (1.000) at least once and in total from 45/77 (0.584) postinoculation samples; median duration of bacterial isolation was 2.4 days post-inoculation. Salmonella was isolated from buccal samples from 7 lambs (0.583) at least once and in total from 10/77 (0.130) post-inoculation samples; median duration of bacterial isolation was 0.8 day post-inoculation. Salmonella was not isolated from any faecal sample from any dam of inoculated lambs; it was isolated from two milk samples, collected from the same ewe, dam of an inoculated lamb, on two consecutive sampling occasions. Finally, Salmonella was isolated from tissue samples of 9 lambs: small intestine of 6 (0.500), abomasum of 4 (0.333), liver of 3 (0.250) and gallbladder of 2 (0.167) lambs. The invA gene was detected in samples from all inoculated lambs and from 3 of their dams. In all samples, of all tissues, that had yielded Salmonella at the microbiological examination, the invA gene was also detected (1.000). Median duration of post-challenge detection of the gene was 5.5 days in faecal samples and 1.3 days in buccal samples. Histopathological examination revealed abomasitis with subepithelial presence of eosinophils, lymphocytes and plasma cells, consistently observed in all lambs. In the small intestine, salient lesions included initially distension and oedema of intestinal villi, leucocytic infiltration and hyperplasia of lymphoid nodules with apparent germinal centres, which were followed at later stages by atrophy and/or degeneration of the lymphoid tissue of the intestine with marked subepithelial infiltration of lymphocytes, plasma cells and eosinophils. General and more specific conclusions derived from the results of the present thesis are as follows. (a) S. enterica subsp. diarizonae is an opportunistic gastrointestinal pathogen in lambs. The bacterium can cause a mild infection, with faecal shedding and definite histopathological changes in the gastrointestinal tract; the bacteria can be isolated from internal organs of infected animals. The bacterium can be a causal agent of the diarrhoeic syndrome of lambs. Faecal shedding of the bacterium is intermittent. Horizontal transmission of the bacterium between animals can be possible; it can be transmitted from lambs to ewes during sucking. Isolation of the organism from the milk of the dams of infected lambs is possible. (b) Differences in severity of infection can be observed among animals and farms. Immunological condition of animals might be a determinant of the severity of the disease.

Η παρούσα διατριβή εστιάζεται στην αξιολόγηση του ρόλου του βακτηρίου Salmonella enterica subsp. diarizonae στην αιτιολογία του διαρροϊκού συνδρόμου των αρνιών και αποσκοπεί ειδικότερα: (α) στη μελέτη της έκτασης της μόλυνσης από S. enterica subsp. diarizonae σε εκτροφές προβάτων με κλινικά περιστατικά διαρροϊκού συνδρόμου των αρνιών και (β) στη μελέτη της παθογένειας της μόλυνσης από S. enterica subsp. diarizonae για τα αρνιά. Η διατριβή χωρίζεται σε τρία κεφάλαια και ακολουθεί η Γενική Συζήτηση. Στο Κεφάλαιο Ι, ανασκοπείται η σχετική βιβλιογραφία. Το Κεφάλαιο υποδιαιρείται σε τρία τμήματα. Στο τμήμα Α, ανασκοπείται συνοπτικά η βιβλιογραφία σχετικά με την ταξινόμηση και της ονοματολογία του γένους Salmonella. Στο τμήμα Β, ανασκοπείται η βιβλιογραφία η σχετική με τις λοιμώξεις από Salmonella στα πρόβατα. Στο τμήμα Γ, ανασκοπείται η βιβλιογραφία η σχετική με τις λοιμώξεις από Salmonella enterica subsp. diarizonae σε ζώα. Στο Κεφάλαιο II, μετά από σύντομη παρουσίαση του βακτηρίου S. enterica subsp. diarizonae στο πλαίσιο του διαρροϊκού συνδρόμου των αρνιών σε εκτροφές προβάτων (Τμήμα Α), παρουσιάζονται αρχικά ένα περιστατικό φυσικής μόλυνσης σε αρνιά που οφειλόταν στο εν λόγω βακτήριο (Τμήμα Β) και στη συνέχεια μία μελέτη στο πεδίο σχετικά με την έκταση της φυσικής μόλυνσης σε εκτροφές προβάτων στην Κεντρική Ελλάδα (Τμήμα Γ). Σε μία εκτροφή προβάτων παρατηρήθηκαν αυξημένα κρούσματα διαρροϊκού συνδρόμου σε νεαρά αρνιά. Τα κρούσματα διάρροιας αφορούσαν σε αρνιά ηλικίας 5 έως 15 ημερών σε περίοδο 7 ημερών. Συνολικά εκδήλωσαν διάρροια 25 νεαρά αρνιά, ποσοστό που αντιστοιχούσε σε 15,6% των αρνιών που είχαν γεννηθεί στην εκτροφή (n = 160). Από αυτά, 10 είχαν ήδη πεθάνει πριν από την επίσκεψη στην εκτροφή (θνησιμότητα: 0,400). Κατά την επίσκεψη, πραγματοποιήθηκε κλινική εξέταση σε ασθενή αρνιά, τα οποία παρουσίαζαν έντονη διάρροια και νεκροτομική εξέταση σε πτώματα δύο αρνιών, με κυριότερα παθολογικά ευρήματα την απουσία περιεχομένου στον γαστρεντερικό σωλήνα, την παρουσία φλεγμονωδών αλλοιώσεων στον πυλωρό, τον ειλεό και το λεπτό έντερο και την παρουσία πολυάριθμων πετεχειών στο τοίχωμα του εντέρου, το οποίο φαινόταν πιο λεπτό από το φυσιολογικό. Ελήφθησαν δείγματα κοπράνων από τα ασθενή ζώα, για βακτηριολογική, ιολογική και παρασιτολογική εξέταση, τα αποτελέσματα των οποίων έδειξαν μόνον παρουσία S. enterica σε καθαρή καλλιέργεια. Το βακτήριο απομονώθηκε επίσης από ιστοτεμάχια λεπτού εντέρου και ήπατος από τα νεκροτομηθέντα αρνιά μετά από βακτηριολογική εξέταση. Τα στελέχη ταυτοποιήθηκαν πλήρως ως Salmonella enterica subsp. diarizonae με τον αντιγονικό συνδυασμό 61:k:1,5,(7). Συνταγογραφήθηκε η θεραπευτική χορήγηση ενροφλοξακίνης στην εκτροφή. Μετά το τέλος της χορήγησης της αγωγής, πραγματοποιήθηκε συλλογή δειγμάτων κοπράνων από τα ζώα της εκτροφής επί 42 ημέρες, από τα οποία απομονώθηκε το βακτήριο 22 ημέρες μετά το τέλος της αγωγής. Ακολούθως, πραγματοποιήθηκε διερεύνηση της παρουσίας του βακτηρίου σε δείγματα κοπράνων αρνιών (n = 119) με διάρροια σε 21 εκτροφές προβάτων στην Κεντρική Ελλάδα. Όλα τα δείγματα εξετάζονταν για την παρουσία Salmonella με βακτηριολογικές τεχνικές. Το βακτήριο δεν απομονώθηκε από κανένα δείγμα από καμία από τις 21 εκτροφές Στο κεφάλαιο ΙΙΙ της παρούσας διατριβής παρουσιάζονται τα αποτελέσματα πειραματικής μόλυνσης για μελέτη της σημασίας του βακτηρίου S. enterica subsp. diarizonae στο διαρροϊκό σύνδρομο των αρνιών. Συνολικά, 12 αρνιά ενοφθαλμίστηκαν με S. enterica subsp. diarizonae, ένα στέλεχος το οποίο είχε απομονωθεί από κλινικό περισταιτκό της μόλυνσης. Ο ενοφθαλμισμός πραγματοποιήθηκε με χορήγηση από το στόμα εναιωρήματος με 0,75 × 109 έως 1,8 × 109 c.f.u. του βακτηρίου. Ως αρνητικοί μάρτυρες χρησιμοποιήθηκαν 4 αρνιά. Σε τακτικά χρονικά διαστήματα, συλλέχθηκαν διαδοχικά δείγματα κοπράνων, αίματος και επιχρίσματος στοματικού βλεννογόνου από όλα τα αρνιά στη μελέτη. Στα ίδια χρονικά σημεία συλλέχθηκαν δείγματα κοπράνων και γάλακτος από όλες τις προβατίνες, μητέρες των ανωτέρω αρνιών. Τα αρνιά θανατώθηκαν διαδοχικά 1, 2, 4, 7, 10, 14 και 21 ημέρες μετά την έναρξη της μελέτης και συλλέχθηκαν δείγματα ιστών από το λεπτό έντερο, το ήνυστρο, το ήπαρ και τη χοληδόχο κύστη, για εξέταση με βακτηριολογικές τεχνικές για απομόνωση και ταυτοποίηση Salmonella και με μοριακές τεχνικές (αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης - PCR) για ανίχνευση του γονιδίου invA του βακτηρίου, καθώς και για ιστοπαθολογική αξιολόγηση. Συνολικά, απομονώθηκε Salmonellla από όλα τα ενοφθαλμισμένα αρνιά (1,000) και συνολικά από 45/77 σχετικά δείγματα κοπράνων (0,584), με διάμεση διάρκεια απομόνωσης 2,4 ημέρες μετά τον ενοφθαλμισμό. Tο βακτήριο απομονώθηκε επίσης από επιχρίσματα στοματικού βλεννογόνου από 7 αρνιά (0,583) και συνολικά από 10/77 (0,130) σχετικά δείγματα, με διάμεση διάρκεια απομόνωσης 0,8 ημέρες μετά τον ενοφθαλμισμό. Salmonella απομονώθηκε επίσης από 2 διαδοχικά δείγματα γάλακτος από μία προβατίνα. Το βακτήριο απομονώθηκε από ιστοτεμάχια συνολικά 9 αρνιών: από το λεπτό έντερο 6 (0,500), το ήνυστρο 4 (0,333), το ήπαρ 3 (0,250) και τη χοληδόχο κύστη 2 (0,167) αρνιών. Το γονίδιο invA ανιχνεύτηκε σε δείγματα από όλα τα ενοφθαλμισμένα αρνιά, με διάμεση διάρκεια ανίχνευσης στα δείγματα κοπράνων 5,5 ημέρες και στα επιχρίσματα στοματικού βλεννογόνου 1,3 ημέρες. Το γονίδιο ανιχνεύτηκε επίσης σε 3 δείγματα γάλακτος από τις μητέρες των ενοφθαλμισμένων αρνιών. Κατά την ιστοπαθολογική εξέταση, παρατηρήθηκε ηνυστρίτιδα με υποεπιθηλιακή συσσώρευση λευκοκυττάρων. Στο λεπτό έντερο, οι αλλοιώσεις αφορούσαν σε διάταση και οίδημα των επιθηλιακών κυττάρων, λευκοκυτταρική διήθηση και υπερπλασία των λεμφοειδών οζιδίων με εμφανή βλαστικά κέντρα αρχικά και ατροφία ή / και εκφύλιση του λεμφοειδούς ιστού του εντέρου με παρουσία λεμφοκυττάρων, πλασμοκυττάρων και εωσινόφιλων κυττάρων υποεπιθηλιακά σε επόμενο στάδιο. Τα συμπεράσματα που προκύπτουν από τα ευρήματα αυτής της διατριβής, είναι τα παρακάτω. (α) Το βακτήριο S. enterica subsp. diarizonae είναι ευκαιριακό παθογόνο του πεπτικού συστήματος σε αρνιά. Το βακτήριο μπορεί να προκαλέσει ήπιας βαρύτητας νόσο, με αποβολή του στα κόπρανα και σαφείς ιστολογικές αλλοιώσεις στα όργανα του γαστρεντερικού σωλήνα. Επίσης, μπορεί να απομονωθεί από εσωτερικά όργανα των προσβεβλημένων αρνιών. Το βακτήριο μπορεί να προκαλέσει διαρροϊκό σύνδρομο σε νεαρά αρνιά. Το βακτήριο μπορεί να μεταδοθεί μεταξύ ζώων, π.χ., μεταδίδεται από τα αρνιά στις προβατίνες κατά το θηλασμό. Η αποβολή του στα κόπρανα είναι διαλείπουσα. Το βακτήριο μπορεί να απομονωθεί από το γάλα προβατίνων με μολυσμένα αρνιά. (β) Παρατηρούνται διαφορές στη βαρύτητα της λοίμωξης από S. enterica subsp. diarizonae μεταξύ ζώων και εκτροφών. Η ανοσοεπάρκεια των μολυσμένων ζώων μπορεί να είναι παράγοντας που επηρεάζει τη βαρύτητα της νόσου.