Παρασιτικές μολύνσεις με Fasciola hepatica σε βιολογικές και συμβατικές εκτροφές μηρυκαστικών

Abstract

A cross sectional survey was performed to explore the epidemiological status of Fasciola hepatica infection (FI), with a view to providing a basis for disease control strategies. The investigation, which covered various areas of Greece and in eastern Europe, focused on: a) the identification of the causative agents of FI in sheep and goats, b) the construction of the risk spatial interpolation map of FI in Thessaly, c) the detection of areas with significant clusters of infection, d) the construction of predicted risk models of FI in Thessaly, and extend this prediction to the entire area of Greece as well as the Mediterranean region, e) the investigation of genetic diversity of liver fluke populations, f) the identification of lineages or groups and how specific are they for each population on the basis of SNP analysis of three different and highly conserved DNA fragments from the south (Greece, Bulgaria) and north (Poland) Europe and g) the modelling of the geographic distribution of the disease agents in Greece and Bulgaria. A total of 346 and 234 faecal samples and 499 and 372 serum samples were collected from sheep and goats respectively from 74 farms in Central Greece. Twelve farms (16.2%) and 58 farms (78.4%) of 74 were found infected using coproantigen and serology respectively. Risk factors related to herd and farmer status, farm and pasture management, and environmental factors derived by satellite data were examined for their association with the prevalence of F. hepatica in sheep and goat farms. The statistical model was a trivariate logistic regression with correlated random effects. A geographic information system (GIS), the spatial statistic analysis and the normalized difference vegetation index (NDVI) were used for mapping the risk of F. hepatica infection and identifying clusters of infection on the basis of high resopositivity determined risk factors in the region of Thessaly, the entire area of Greece and the Mediterranean basin. The genetic diversity of liver fluke populations in three different countries from Eastern Europe (Greece, Bulgaria, and Poland) in comparison with available data from other countries was determined. Specifically, SNPs from regions of two nuclear genes, 28S rDNA, β-tubulin isotype 3 and an informative region of the mitochondrial genome were examined. Two major lineages for the 28S rDNA gene based on the highly polymorphic 105th nucleotide position were found. Two basic lineages and additional haplotypes were defined for the mtDNA gene region. Additional genotypes for the 28S rDNA region as well as haplotypes of the mtDNA region that were typical for the Greek or Polish populations were observed. For the β-tubulin isotype 3 gene multiple polymorphic sites were revealed but no explicit clades. It is hypothesized that genotypic differences between Greek, Bulgarian, and Polish liver fluke populations are due to territorial division and genetic drift in past epochs. Maximum entropy ecological niche modelling was utilized to predict the geographic range for fluke genotypes and haplotypes in Greece and Bulgaria, using the Maxent program. In regard to mtDNA gene region, precipitation is the most important factor in modelling CtCmt1 haplotype range, while temperature appears to be the most important factor in modelling the CtCmt2.1 and CtCmt2.2 haplotype ranges. The highest level of probability for the geographic distribution of F. hepatica genotypes and haplotypes covered Southern Bulgaria and Central and Northern Greece regions which contain a high concentration of potential ruminant hosts.

Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν η διενέργεια επιζωοτιολογικής έρευνας χρονικού σημείου για να μελετηθεί η κατάσταση της φασιόλωσης στα μηρυκαστικά, με στόχο τη συλλογή πληροφοριών για την κατάρτιση στρατηγικών ελέγχου της ασθένειας. Η έρευνα, που κάλυψε διάφορες περιοχές της Ελλάδας και της ανατολικής Ευρώπης είχε ως σκοπό: α) τον προσδιορισμό του επιπολασμού του F. hepatica στα αιγοπρόβατα της Θεσσαλίας, β) το σχεδιασμό χάρτη χωρικής παρεμβολής της σχετικής επικινδυνότητας μόλυνσης με F. hepatica στη Θεσσαλία, γ) την ανίχνευση των περιοχών με σημαντικές εστίες μόλυνσης, δ) την κατασκευή μοντέλου πρόβλεψης σχετικής επικινδυνότητας της μόλυνσης με F. hepatica στη Θεσσαλία, στην Ελλάδα και στη λεκάνη της Μεσογείου, ε) τη διερεύνηση της γενετικής ποικιλομορφίας, στ) τον προσδιορισμό φυλογενετικών ομάδων μεταξύ του πληθυσμού των παρασίτων από την νότια (Ελλάδα, Βουλγαρία) και βόρεια (Πολωνία) Ευρώπη και ζ) τη μοντελοποίηση της γεωγραφικής κατανομής των γονότυπων και απλότυπων που βρέθηκαν στην Ελλάδα και τη Βουλγαρία. Για τον σκοπό αυτό εξετάστηκαν 346 και 234 δείγματα κοπράνων και 499 και 372 δείγματα ορού αίματος από πρόβατα και αίγες αντίστοιχα, 74 βιολογικών και συμβατικών εκτροφών της Θεσσαλίας. Ο επιπολασμός σε επίπεδο εκτροφής ήταν 16.2% (12/74) με τη δοκιμασία του κοπροαντιγόνου και 78.4% (58/74) με τη δοκιμασία ELISA. Παράγοντες σε σχέση με τα χαρακτηριστικά και τη διαχείριση του κοπαδιού, τα χαρακτηριστικά του παραγωγού και τα περιβαλλοντικά δεδομένα επιλέχθηκαν ώστε να διευρυνθεί η επικινδυνότητά τους στην εμφάνιση του παρασίτου στις εξεταζόμενες εκτροφές. Το στατιστικό μοντέλο ήταν τρισδιάστατης λογιστικής παλινδρόμησης με συσχετισμένους τυχαίους παράγοντες. Το σύστημα γεωγραφικών πληροφοριών (GIS), η χωρική στατιστική ανίχνευση και ο δείκτης βλάστησης κανονικοποιημένης διαφοράς (NDVI) χρησιμοποιήθηκαν για τη χαρτογράφηση της σχετικής επικινδυνότητας με F. hepatica και την ανίχνευση των περιοχών με σημαντικές εστίες μόλυνσης με βάση τη δοκιμασία της υψηλής οροθετικότητας στη Θεσσαλία και γενικότερα την Ελλάδα και τη λεκάνη της Μεσογείου. Καθορίστηκε η γενετική ποικιλομορφία ενήλικων παρασίτων F. hepatica προερχόμενα από την Ελλάδα, τη Βουλγαρία και Πολωνία. Συγκεκριμένα, μελετήθηκαν γενετικοί μονονουκλεοτιδικοί πολυμορφισμοί επιλεγμένων τμημάτων των γονιδίων του 28S rDNA, του μιτοχονδριακού (mt) DNA και της β-σωληνίνης 3. Βρέθηκαν δυο γονότυποι με βάση τον πολυμορφισμό του 105ου νουκλεοτιδίου για το επιλεγμένο τμήμα του 28S rDNA γονιδίου και δύο κύριοι απλότυποι για την επιλεγμένη περιοχή του mtDNA. Παρατηρήθηκαν πρόσθετοι γονότυποι για το γονίδιο 28S rDNA, καθώς και απλότυποι του επιλεγμένου τμήματος του mtDNA οι οποίοι ήταν χαρακτηριστικοί για τα παράσιτα που προέρχονταν από την Ελλάδα και την Πολωνία. Για τμήμα του γονίδιου της β-σωληνίνης 3, παρόλο που βρέθηκαν πολυμορφικές περιοχές, ήταν αδύνατο να διαχωριστεί ο πληθυσμός των παρασίτων σε γονότυπους. Οι γονοτυπικές διαφορές μεταξύ των παρασίτων από την Ελλάδα, Βουλγαρία και Πολωνία ίσως να οφείλονται σε εδαφική και πληθυσμιακή διαίρεσή παρελθόντων περιόδων. Η μοντελοποίηση, με τη χρήση του αλγόριθμου της μέγιστης εντροπίας (πρόγραμμα Maxent) χρησιμοποιήθηκε για τη διαμόρφωση της γεωγραφικής κατανομής των γονότυπων και απλότυπων που βρέθηκαν στην Ελλάδα και τη Βουλγαρία. Όσον αφορά στο επιλεγμένο τμήμα του mtDNA, οι μεταβλητές της βροχόπτωσης διαμόρφωσαν τη γεωγραφική κατανομή του CtCmt1 απλότυπου, ενώ οι μεταβλητές της θερμοκρασίας διαμόρφωσαν τη γεωγραφική κατανομή των CtCmt2.1 και CtCmt2.2 απλότυπων. Προσδιορίστηκε ότι η πιθανότερη παρουσία των γονότυπων και απλότυπων του F. hepatica βρίσκεται στη νότια Βουλγαρία, στην κεντρική και βόρεια Ελλάδα, όπου εκτρέφεται και στις δυο χώρες μεγάλος αριθμός μηρυκαστικών.