Η επίδραση της γενετικής ποικιλομορφίας της καψιδιακής πρωτεΐνης του ιού της ηπατίτιδας C στην ανάπτυξη του ηπατοκυτταρικού καρκινώματος, μέσω της ρύθμισης του κυτταρικού σηματοδοτικού μονοπατιού wnt/ β κατενινίνη

Abstract

Clinical studies have suggested that some hepatitis C virus (HCV) genotypes or isolates are associated with disease progression and hepatocellular carcinoma development (HCC). In addition to its known role in viral particle, HCV core protein may be directly involved in these pathogenic features affecting host’s signaling pathways. HCV core protein was shown to interfere with host Wnt/ β-cateninpathway. This work aims at investigating the role of HCV core genetic variability in the regulation of the Wnt/ β-cateninpathway during HCV infection. TCF element transactivational activity was assessed in transiently transfected cell lines expressing HCV core protein variants derived from clinical isolates of subtypes 1a, 4aR and 4fC. We demonstrated that HCV core protein up-regulates TCF element transactivation in a strain-specific manner, in transiently transfected cells, through a mechanism involving PI3K activation. Site-directed mutagenesis confirmed the role of amino acid Thr71 and Ser64 on TCF element transactivation. Genome-length recombinant chimeras were generated by exchanging the core-coding region of cell-culture adapted JFH1-derived strain with equivalent sequences from clinical isolates. After characterization of the new intergenotypic chimeric viruses high titer stocks were produced. qPCR, confocal microscopy and image analysis was performed to monitor the activation status of Wnt/ β-cateninpathway determinants during infection. In agreement, infection of hepatic cells with core-intergenotypic recombinant viruses resulted in strain-specific transcriptional up-regulation of TBX3, c-myc, Axin2, Fibronectin, FASN and cyclin D1 genes and nuclear translocation of β-catenin. Intergenotypic core recombinant viruses revealed a putative functional domain within region 64-71 aa of core that may interact with cellular proteins which leads to Wnt/ β-cateninpathway activation. Further studies are conducted to identify this cellular target and define the molecular mechanism of core action. HCV core intergenotypic recombinants developed provide a model system to study the role of HCV core natural mutations in the dysregulation of host pathways associated with liver disease in a relevant infection system, like primary cell lines and animal model systems. This study is expected to shed light on the molecular mechanisms underlying the association between hepatitis C virus genomic variability and hepatocellular carcinoma development.

Δεδομένα από κλινικές έρευνες υποστηρίζουν ότι κάποιοι γενότυποι ή στελέχη του ιού της ηπατίτιδας C (HCV) σχετίζονται με την εξέλιξη της νόσου και την ανάπτυξη ηπατοκυτταρικού καρκινώματος (HCC). Η πρωτεΐνή core του ιού της ηπατίτιδας C, επιπρόσθετα του γνωστού της ρόλου στο σχηματισμό του καψιδίου, εμπλέκεται άμεσα στην παθογένεια που προκαλείται από τον ιό, επηρεάζοντας την φυσιολογική λειτουργία σημαντικών μονοπατιών σηματοδότησης του ξενιστή. Ένα από τα κυτταρικά μονοπάτια στα οποία εμπλέκεται η πρωτεΐνη core είναι ο καταρράκτης σηματοδότησης Wnt/ β-catenin. Στόχος της διδακτορικής διατριβής είναι η μελέτη του ρόλου της γενετικής ποικιλομορφίας της γονιδίου core στην ρύθμιση του μονοπατιού Wnt/ β-catenin κατά την διάρκεια της μόλυνσης από τον ιό της ηπατίτιδας C. Η ενεργότητα του στοιχείου TCF, το οποίο ρυθμίζεται θετικά από την ενεργοποίηση του μονοπατιού WNT/ β-catenin, καθώς και ο ρόλος άλλων στοιχείων του μονοπατιού, μελετήθηκαν σε παροδικά μετασχηματισμένες κυτταρικές σειρές του εκφράζουν στελέχη της πρωτεΐνης core προερχόμενα από κλινικά δείγματα των υποτύπων 1a, 4a και 4f του ιού της ηπατίτιδας C. Ταυτοποιήσαμε σε παροδικά μετασχηματισμένα κύτταρα ότι η πρωτεΐνη core ενεργοποιεί το στοιχείο TCF με ένα τρόπο που εξαρτάται από την αλληλουχία της πρωτεΐνης core. Με την μέθοδο της στοχευμένης μεταλλαξιγένεσης επιβεβαιώθηκε ο ρόλος των αμινοξέων θρεονίνη στη θέση 71 και σερίνη στη θέση 64 στην ενεργοποίηση του στοιχείου TCF. Στη συνέχεια, κατασκευάστηκαν γονιδιώματα ανασυνδυασμένων χιμαιρών αντικαθιστώντας τις αλληλουχίες που κωδικοποιούν την πρωτεΐνη core του στελέχους adapted-JFH1 με τις αντίστοιχες αλληλουχίες από κλινικά δείγματα των υποτύπων 1a, 4a και 4f του ιού της ηπατίτιδας C. Οι νέοι δια-γενοτυπικοί χιμαιρικοί ιοί χαρακτηρίστηκαν και ακολούθησε η παρασκευή ιικών αποθεμάτων υψηλού τίτλου. qPCR ανάλυση, μικροσκοπία confocal και ανάλυση των εικόνων πραγματοποιήθηκαν για να μελετηθεί η ενεργότητα στοιχείων του μονοπατιού Wnt/ β-cateninκατά την διάρκεια της μόλυνσης ηπατικών κυττάρων με τους νέους ανασυνδυασμένους ιούς. Σε συμφωνία με τα αποτελέσματα παροδικού μετασχηματισμού, η μόλυνσης ηπατοκυττάρων με τους core-διαγονιδιακούς ιούς είχε ως αποτέλεσμα την ενεργοποίηση γονιδίων στόχων του μονοπατιού Wnt/ β- catenin, TBX3, c-MYC, Axin2, Fibronectin, FASN and cyclin D1, αλλά και τον πυρηνικό εντοπισμό της β-catenin πρωτεΐνης με τρόπο που εξαρτάται από το στέλεχος της πρωτεΐνης core. Τα δεδομένα αυτά αποκάλυψαν μια πιθανή λειτουργική περιοχή της πρωτεΐνης core (αμινοξέα 64-71), που πιθανά αλληλεπιδρά με κυτταρικές πρωτεΐνες και τελικά προκαλεί να ενεργοποίηση του μονοπατιού Wnt/ β-catenin. Επιπλέον έρευνες πραγματοποιούνται για να ταυτοποιηθεί η κυτταρική πρωτεΐνη στόχος και να χαρακτηριστεί ο μοριακός μηχανισμός δράσης της πρωτεΐνης core. Το σύστημα των core-διαγενοτυπικών ανασυνδυασμένων ιών καθιστά ένα μοντέλο μελέτης του ρόλου των φυσικών μεταλλάξεων του γονιδίου core του ιού της ηπατίτιδας C στην απορύθμιση των κυτταρικών μονοπατιών του ξενιστή, που σχετίζονται με την ανάπτυξη ασθένειας στο ήπαρ. Με το σύστημα αυτό είναι εφικτή η μελέτη του ρόλου της γενετικής ποικιλομορφία του γονιδίου core του ιού της ηπατίτιδας C σε μολυσματικά μοντέλα, όπως πρωτογενής κυτταρικές σειρές και μοντέλα πειραματόζωων. Η εργασία αυτή θα βοηθήσει στη κατανόηση του μοριακού μηχανισμού ανάπτυξης ηπατοκυτταρικού καρκινώματος που σχετίζεται με την γενετική ποικιλομορφία του γονιδίου core του ιού της ηπατίτιδας C.