Μελέτη της τροποποίησης της σηματοδότησης των MAPKs-p38 παρουσία των δομικών πρωτεϊνών του ιού της ηπατίτιδας C ( HCV)

Abstract

Hepatitis C virus (HCV) is a major cause of chronic hepatitis worldwide and often leads to chronic liver disease and hepatocellular carcinoma. The virus typically establishes a chronic infection in the liver that can promote serious hepatic disorders, such as hepatocellular carcinoma, over a period of decades. Although HCV is an enveloped virus, naked nucleocapsids have been reported in the serum of infected patients, and recently novel HCV subgenomes with deletions of the envelope proteins have been identified. Initial studies from our laboratory, previously published, indicated that expression of HCV core in insect cells can direct the formation of capsid-like particles lacking the envelope glycoproteins. These protein nanospheres, morphologically similar to natural capsids, were shown to be taken up by human hepatic cells and to produce cell signalling events. To follow the intracellular fate of these particles we fused the core protein to eGFP. We demonstrate that the chimeric proteins can be efficiently expressed, self-assembled, and form fluorescent non-enveloped capsid-like particles. Using FACS analysis, we provide evidence that the fluorescent particles can enter human immune cells such as T and B lymphocytes, as well as human myeloid leukaemia cells differentiated along the monocyte/macrophage-like pathway. Despite the fact that HCV is mainly a hepatotropic virus, it has been shown to infect and actively replicate in cells of the immune system altering their function and their cytokine expression. Using the baculovirus expression system we have generated recombinant non-enveloped capsid-like particles (HCVne) in the absence of other viral proteins and investigated their interference with signalling pathways in T-cells. HCVne internalisation was verified in Jurkat and Hut 78 T-cells, as well as primary human PBMCs and intrahepatic mononuclear cells. HCVne uptake leads to activation of the MAPKs (p38 and ERKs) signalling pathway. Using specific phosphoantibodies, signalling pathways inhibitors and chemical agents, was demonstrated that p38 activation in T-cells correlated with IL-2 transcriptional activation. c-fos and egr-1, two transcription factors, essential for IL-2 promoter activity, were also found elevated. In parallel, phosphorylated p38 translocates to the nucleus and phosphorylates CREB. All these transcription factors bind to IL-2 promoter and activate IL-2 gene transcription. Furthermore, HCVne uptake was accompanied with a parallel increase of IL-2 cytokine secretion. We propose that HCVne uptake by T-lymphocytes results in increased MAPKs activity and IL-2 expression, thus altering the host immune response.

Ο ιός της ηπατίτιδας C (ΗCV) αποτελεί έναν από τους κύριους αιτιολογικούς παράγοντες της χρόνιας ηπατίτιδας και αποτελεί ένα από τα σημαντικότερα προβλήματα της δημόσιας υγείας. Το αυξημένο ποσοστό μετάπτωσης της HCV λοίμωξης σε χρόνια νόσο είναι δυνατόν να οφείλεται στην ικανότητα του ιού να μολύνει και να πολλαπλασιάζεται τόσο στα ηπατοκύτταρα, που είναι ο κύριος ξενιστής του ιού, όσο και στα λεμφοκύτταρα. Ο HCV ανήκει στην οικογένεια Flaviviridae και καψίδιο μικρής διαμέτρου που περιβάλλεται από μεμβρανικό φάκελο. Παρόλα αυτά έχουν ανιχνευτεί διαφορετικοί πληθυσμοί ιικών σωματιδίων στον ορό των ασθενών, με χαρακτηριστική την ύπαρξη γυμνών νουκλεοκαψιδίων χωρίς φάκελο. Ο ρόλος των γυμνών καψιδίων στη φυσική πορεία της λοίμωξης καθώς και ο μηχανισμός απελευθέρωσης τους στην κυκλοφορία του αίματος των ασθενών δεν είναι ακόμη γνωστά. Επίσης έχει αναφερθεί η παρουσία ελλειμματικών γονιδιωμάτων του ιού, στο ήπαρ και τον ορό ορισμένων ασθενών, ικανών να περικλείονται σε καψίδια. Η παρούσα εργασία επικεντρώθηκε στην κατασκευή ανασυνδυασμένων βακουλοιών, μέσω των οποίων επιτεύχθηκε απομόνωση και χαρακτηρισμός γυμνών core καψιδίων με ή χωρίς την ιδιότητα φθορισμού. Στη συνέχεια, έγινε διερεύνηση της πρόσδεσης και της εισόδου των GFP-συζευγμένων καψιδίων σε κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος, με τη χρήση κυτταρομετρίας ροής. Ειδικότερα σε ότι αφορά τα γυμνά καψίδια (HCVne), επιβεβαιώθηκε η πρόσδεση και η είσοδος τους στα Jurkat και Hut-78 Τ-λεμφοκύτταρα, καθώς και σε πρωτογενή Τ-λεμφοκύτταρα, είτε περιφερικά είτε ηπατο-διηθούμενα. Επιπρόσθετα, μελετήθηκε και βρέθηκε ότι η είσοδος των HCVne οδηγεί στην παράλληλη ενεργοποίηση των MAPKs σηματοδοτικών μονοπατιών p38 και ERK. Με τη χρήση ειδικών αντισωμάτων, αναστολέων καθώς και πλασμιδίων αναφοράς μελετήθηκε το p38 σηματοδοτικό μονοπάτι που καταλήγει στη μεταγραφική ενεργοποίηση και έκκριση της ιντερλευκίνης IL-2. Στην παρούσα εργασία δείχθηκε ότι η HCVne-επαγόμενη p38 φωσφοσφορυλίωση οδηγεί στην ενεργοποίηση των μεταγραφικών παραγόντων CREB, EGR-1 και c-Fos, οι οποίοι στη συνέχεια προσδένονται στον υποκινητή της IL-2 και ενεργοποιούν τη μεταγραφή της. Η μελέτη των μηχανισμών που εμπλέκονται στην παρεμπόδιση της λειτουργίας του ανοσοποιητικού συστήματος του ξενιστή αποτελούν αντικείμενα εκτεταμένης έρευνας καθώς θα συμβάλλουν στην κατανόηση των μηχανισμών της παθογένειας της ηπατίτιδας C καθώς και της χρόνιας εμμένουσας λοίμωξης. Βασικός στόχος της παρούσας διατριβής είναι να συμβάλλει προς αυτήν την κατεύθυνση, μελετώντας την HCVne- επαγόμενη σηματοδότηση στα Τ-λεμφοκύτταρα. Συμπερασματικά η παρούσα μελέτη δείχνει ότι η είσοδος των HCVne οδηγεί σε αυξημένη ενεργότητα των MAPKs και σε αύξηση της έκφρασης της IL-2, τροποποιώντας έτσι την ανοσολογική απόκριση του ξενιστή.