Συσχέτιση γονιδιωματικών βιοδεικτών σε γονίδια της οικογένειας KLF με τα επίπεδα της εμβρυϊκής αιμοσφαιρίνης στον άνθρωπο: προεκτάσεις στην εξατομίκευση της θεραπείας με υδροξυουρία ασθενών με β- τύπου αιμοσφαιρινοπάθειες

Abstract

Hemoglobinopathies, including sickle-cell disease (SCD) and beta-thalassemia are among the most common monogenic disorders worldwide. They are mainly characterized by either defective or downrated to absent synthesis of one of the two polypeptide chains of hemoglobin. To date, the therapeutic options for treatment are limited. One of the most promising therapeutic approaches is the induction of γ globin genes, in order to increase the fetal hemoglobin levels and, as a result, to improve the patients`clinical picture. Thus, a large number of studies currently focus on transcription factors involved in the regulation of fetal hemoglobin.The only drug found to transiently reactivate the γ globin levels in patients suffering from SCD, and which is currently approved by the Food and Drug Administration (FDA) is hydroxyurea (HU). Several studies regarding HU administration in β-type hemoglobinopathies resulted in highly variable responses among patients to HU.Kruppel like factors (KLFs) constitute a family of transcription factors with a wide range of functions, including the regulation of the expression of globin genes during the different human developmental stages.At the current study, four tagSNPs (tagging single nucleotide polymorphisms), namely the rs2242189, rs2236599, rs11142398 and rs980112, located in four different Klf genes (Klf3, Klf4, Klf9 and Klf10 respectively) were studied, in order to examine (i) whether they were associated with increased HbF levels, thus affecting the β-thalassemia patients` condition, and (ii) their possible association with HU response in double heterozygous (SCD and beta-thalassaemia) patients. For this purpose, blood samples from (a) healthy non-thalassemic individuals; (b) transfusion-dependent beta-thalassemic patients; (c) non-transfusion-dependent beta thalassemic patients and (d) double heterozygous (SCD/b-thal) patients were analyzed by genotyping the abovementioned SNPs. The double heterozygous patients, to whom HU was administered, were divided into responders and non-responders to HU treatment, using two different criteria: (i) the increase of HbF levels above 20% and (ii) the three-fold increase of HbF levels.Target sequences were amplified by PCR and genotyped by either RFLP (restriction fragment length polymorphism) or Sanger chromosequencing; statistical analysis on the genotypes` and alleles` frequencies followed.The results of our study showed that under the >20% level increase criterion the rs2236599, located in Klf4, seems to be related (p=0,0396) with the response of double heterozygous patients to HU and that rs980112, located in Klf10, seems to be associated (p=0,0431) with the increased fetal hemoglobin levels on non-transfusion-dependent thalassemia patients.

Οι αιμοσφαιρινοπάθειες, συμπεριλαμβανομένης της δρεπανοκυτταρικής αναιμίας και της β-θαλασσαιμίας, συγκαταλέγονται ανάμεσα στις πλέον κοινές μονογονιδιακές διαταραχές παγκοσμίως. Γνώρισμά τους είναι οι ανωμαλίες είτε στη δομή είτε στην ποσότητα μιας εκ των δύο σφαιρινικών υπομονάδων α και β. Ως και σήμερα, οι θεραπευτικές προσεγγίσεις για την αντιμετώπισή τους είναι περιορισμένες. Ένας τρόπος θεραπείας που θεωρείται πολλά υποσχόμενος είναι η επαγωγή της γ-σφαιρίνης, με απώτερο σκοπό την αύξηση των επιπέδων της εμβρυικής αιμοσφαιρίνης HbF, προς βελτίωση της κλινικής εικόνας των ασθενών.Η μοναδική φαρμακευτική ουσία που έχει λάβει την έγκριση του Οργανισμού Τροφίμων και Φαρμάκων των Ηνωμένων Πολιτειών Αμερικής (FDA) για την επαγωγή της HbF σε δρεπανοκυτταρικούς ασθενείς είναι η υδροξυουρία (HU). Υπάρχει πληθώρα μελετών που αφορούν τη χορήγηση της HU σε πάσχοντες από β-θαλασσαιμία και που έχουν καταδείξει μεγάλη ετερογένεια στην ανταπόκριση των ασθενών σε αυτή. Έτσι, ένας μεγάλος αριθμός αυτών των μελετών επικεντρώνεται στους μεταγραφικούς παράγοντες που συμμετέχουν στη ρύθμιση της παραγωγής της εμβρυικής αιμοσφαιρίνης.Μια τέτοια οικογένεια μεταγραφικών παραγόντων είναι και αυτοί της οικογένειας τύπου Kruppel, οι οποίοι μεσολαβούν στην εναλλαγή της έκφρασης των γονιδίων των δύο σφαιρινικών συμπλεγμάτων (α και β) στη μεταστροφή των αιμοσφαιρινών κατά την ανάπτυξη. Στην παρούσα μελέτη εξετάστηκαν 4 μονονουκλεοτιδικοί πολυμορφισμοί επισήμανσης που εδράζονται σε 4 γονίδια Klf (συγκεκριμένα, οι πολυμορφισμοί rs2242189, rs2236599, rs11142398 και rs980112 των γονιδίων Klf3, Klf4, Klf9, Klf10 αντιστοίχως). Διερευνήθηκε τόσο η πιθανή τους συσχέτιση με τα αυξημένα επίπεδα της εμβρυικής αιμοσφαιρίνης, άρα και με την ηπιότερη κλινική εικόνα των β-θαλασσαιμικών ασθενών, όσο και η αντίστοιχη πιθανή συσχέτισή τους με την ανταπόκριση των διπλών ετεροζυγωτών σε β-θαλασσαιμία και δρεπανοκυτταρική αναιμία ασθενών στην θεραπεία με υδροξυουρία. Χρησιμοποιήθηκαν δείγματα (i) ατόμων υγιών, (ii) πασχόντων από εξαρτώμενη μεταγγίσεων β-θαλασσαιμία, (iii) πασχόντων από μη εξαρτώμενη μεταγγίσεων β-θαλασσαιμία και (iv) διπλά ετερόζυγων σε β-θαλασσαιμία και δρεπανοκυτταρική αναιμία, που λάμβαναν ως θεραπευτική αγωγή την υδροξυουρία. Η τελευταία κατηγορία πασχόντων διακρίθηκε περαιτέρω σε ανταποκρινόμενους στη θεραπεία με HU και σε μη ανταποκρινόμενους στη συγκεκριμένη θεραπεία με τη χρήση δύο κριτηρίων: του κριτηρίου αύξησης των επιπέδων της HbF σε ποσοστό μεγαλύτερο του 20% και του κριτηρίου τριπλασιασμού τους. Η ενίσχυση των αλληλουχιών πραγματοποιήθηκε με αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης και η γονοτύπηση είτε με RFLP ή με αλληλούχηση κατά Sanger. Ακολούθησε η στατιστική επεξεργασία των συχνοτήτων, τόσο στα αλληλόμορφα όσο και στους γονοτύπους των μελετούμενων ενδεικτικών πολυμορφισμών.Τα αποτελέσματα της στατιστικής ανάλυσης κατέδειξαν (Ι) πως ο πολυμορφισμός rs2236599 του Klf4 σχετίζεται πιθανώς (p=0,0396) με την ανταπόκριση των διπλά ετερόζυγων ασθενών στην υδροξυουρία (βάσει του κριτηρίου αύξησης των επιπέδων της HbF σε ποσοστό μεγαλύτερο του 20%) και (ΙΙ) πως ο πολυμορφισμός rs980112 του Klf10 είναι πιθανό να σχετίζεται σημαντικά (p=0,0431) με αυξημένα επίπεδα εμβρυικής αιμοσφαιρίνης HbF στους ασθενείς με μη εξαρτώμενη μεταγγίσεων β-θαλασσαιμία και, συνεπώς, με την ηπιότερη κλινική τους εικόνα.