Μελέτη του ρόλου του διαλυτού και διαμεμβρανικού TNF κατά την παθολογία του ΚΝΣ

Abstract

TNF is a member of a large family of cytokines and has multiple roles in the CNS. Regulated TNF production is necessary for successful host defense responses against infection and for tissue repair mechanisms. On the other hand, deregulation of TNF production and molecular signaling leads to chronic inflammation and immune activation, which can lead to autoimmunity. Increased TNF levels have been associated with inflammatory autoimmune diseases, including neurodegenerative CNS disorders such as multiple sclerosis (MS). However, while TNF inhibitors are blockbuster drugs for chronic immune diseases in the periphery, such as rheumatoid arthritis, they exacerbate disease in MS patients, induce de novo demyelination in patients treated for other diseases, and even cause MS. These clinical data clearly show that TNF has overall beneficial effects in the CNS. In experimental models for MS, TNF receptor 1 (TNFR1) mediates the detrimental pro- inflammatory effects of soluble TNF (solTNF), whereas TNFR2 and transmembrane TNF (tmTNF) are essential for beneficial effects, mainly in myelin maintenance and repair. This mechanistic framework supports the use of novel selective inhibitors of solTNF and/or TNFR1, or TNFR2 agonists, for safer therapy of chronic inflammatory diseases including those of the CNS. A potential obstacle to such an approach is substantial evidence that TNF has neuroprotective effects against a wide variety of oxidative and excitotoxic stimuli when used to pretreat cultured neurons, and that protection involves both TNFR1 and TNFR2. However, the relevance of these effects for CNS protection in vivo have yet to be proven and is this subject of this thesis. In a separate line of investigation, previous studies in our lab show that, similar to TNF, conditioned medium from MSC has neuroprotective effects against glutamate excitotoxicity when used to pretreat cultured neurons. MSC provide therapeutic effects in experimental CNS disease models and therefore show promise as cell-based therapies for humans. However, their modes of action, and whether TNF is secreted and involved in their neuroprotection, need to be elucidated. To address the questions described above, we used a genetic approach, combining mice with conventionally and conditionally targeted genes for TNF and its receptors, with an in vitro of glutamate excitotoxicity and in vivo models for multiple sclerosis. Glutamate, and specifically NMDA excitotoxicity, was used because it is directly relevant for neuronal death in a wide variety of neurodegenerative disorders including MS. The NMDA, AMPA and kainate receptors belong to the family of ionotropic glutamate receptors and bind glutamate, which is the major excitatory neurotransmitter in the mammalian CNS. Under certain conditions, dysregulated glutamate function can lead to pathology. High levels of glutamate are toxic for neurons and induce so-called excitotoxic death resulting from increased calcium influx into the cell via the NMDA receptors. First the neuroprotective function of TNF against NMDA-mediated excitotoxicity in vitro was verified. Specifically, pre-incubation of mixed astrocyte-neuron co-cultures with exogenous solTNF protected neurons against NMDA-induced excitotoxicity. Similar neuroprotection was observed after pre-incubation of the cultures with conditioned medium from MSC (MSC CM). Indeed, MSC CM was found to contain measurable TNF bioactivity, and pre-treatment of MSC CM with the TNF inhibitor etanercept reduced its ability to protect neurons, suggesting that MSC-mediated neuroprotection against glutamate excitotoxicity involves, in part, the production of TNF. Subsequently, the cellular and molecular mechanisms by which pre-treatment of cortical neurons with TNF leads to neuroprotection against NMDA-induced excitotoxicity in vitro, were investigated. For this, astrocytes and neurons were isolated from the cortex of wild-type mice or mice deficient in TNF or TNF receptors, and different combinations of wildtype and knockout cells were used to generate astrocyte- neuron co-cultures. It was found that preconditioning of cultures with exogenous solTNF activates astrocytes through TNFR1 to produce tmTNF, which in turn induces neuroprotection mainly via neuronal TNFR2. Specifically, solTNF protects cortical neurons against NMDA-induced excitotoxicity. The in vivo relevance of TNF neuroprotection to MS, was investigated by cell-specific gene targeting of TNFR1 and TNFR2 specifically in excitatory glutamatergic neurons in mice and study of their effect in two experimental MS models, experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) and cuprizone demyelination (CPZ). In contrast to the in vitro results, neuronal TNFR1 promoted disease onset in EAE and CPZ, via activation of its downstream mediator IKKβ. In addition, neuronal TNFR1 increased oligodendrocyte loss and axon damage in CPZ. On the other hand, neuronal TNFR2 did not alter the onset or progression of disease in either of the experimental MS models studied. These results show that the neuroprotective effects of TNF observed in vitro do not protect mice against the development of clinical symptoms or neuropathology typical of MS, in the EAE or CPZ models, and provide full support for the development of novel therapeutic strategies aimed at selectively inhibiting solTNF and/or TNFR1 for the treatment of CNS inflammatory diseases such as MS.

Ο Παράγοντας Νέκρωσης Όγκου (Tumor Necrosis Factor, TNF) είναι μέλος μίας μεγάλης οικογένειας κυτταροκινών και έχει πολλαπλούς ρόλους στο Κεντρικό Νευρικό Σύστημα (ΚΝΣ). Ελεγχόμενη παραγωγή του είναι απαραίτητη για την τοπική άμυνα έναντι λοιμώξεων αλλά και για την αποκατάσταση ιστών. Από την άλλη, απορρύθμιση της παραγωγής του, και των μοριακών μονοπατιών σηματοδότητσης που ενεργοποιεί, οδηγεί σε χρόνια φλεγμονή, η οποία εν συνεχεία μπορεί να οδηγήσει ακόμα και στην εκδήλωση αυτοάνοσων νοσημάτων. Αυξημένα επίπεδα TNF έχουν συσχετισθεί με φλεγμονώδεις αυτοάνοσες ασθένειες, συμπεριλαμβανομένων νευροεκφυλιστικών παθήσεων του ΚΝΣ, όπως η Σκλήρυνση Κατά Πλάκας (ΣΚΠ). Η κλινική χρήση μη ειδικών αναστολέων του TNF αποτελεί τη βασική φαρμακευτική προσέγγιση έναντι πολλών χρόνιων ανοσολογικών παθήσεων της περιφέρειας, όπως η ρευματοειδής αρθρίτιδα, η νόσος του Crohn κ.α. Παρόλα αυτά, η χρήση των φαρμάκων αυτών σε ασθενείς με ΣΚΠ επιδείνωσε την κλινική τους συμπτωματολογία, προκάλεσε de novo απομυελίνωση σε ασθενείς με άλλες ασθένειες, ενώ σε κάποιες περιπτώσεις προκάλεσε ακόμα και την ίδια την ασθένεια. Αυτά τα κλινικά δεδομένα φανερώνουν ότι ο TNF έχει και ευεργετικές δράσεις στο ΚΝΣ, που αξίζει να μελετηθούν διεξοδικά για το μελλοντικό σχεδιασμό ασφαλών θεραπευτικών προσεγγίσεων.Σε προ-κλινικό επίπεδο, συγκεκριμένα σε πειραματικά μοντέλα της ΣΚΠ, έχει δειχθεί ότι στο ΚΝΣ η διαλυτή μορφή του TNF (solTNF) δρα μέσω του υποδοχέα 1 (TNFR1) και έχει επιβλαβείς φλεγμονώδεις δράσεις, ενώ η διαμεμβρανική του μορφή (tmTNF) δρα κυρίως μέσω του υποδοχέα 2 (TNFR2) και έχει ευεργετικές δράσεις, που σχετίζονται κυρίως με τη διατήρηση και την αποκατάσταση της μυελίνης. Αυτή η μηχανιστική και λειτουργική διαφοροποίηση του TNF φανερώνει την ανάγκη δημιουργίας και χρήσης νέων ειδικών αναστολέων έναντι μονάχα της διαλυτής του μορφής, ή ειδικών ενεργοποιητών του TNFR2, για την ασφαλή θεραπεία χρόνιων φλεγμονωδών ασθενειών, συμπεριλαμβανομένων και αυτών του ΚΝΣ. Ένα πιθανό εμπόδιο σε μια τέτοια προσέγγιση είναι το in vitro εύρημα ότι ο TNF, όταν προ- επωάζεται σε καλλιέργειες νευρώνων, έχει νευροπροστατευτική δράση έναντι ενός ευρέος φάσματος οξειδωτικών και διεγερσιτοτοξικών ερεθισμάτων, φαινόμενο που εμπλέκει και τους δύο υποδοχείς του. Ωστόσο, ο ακριβής μηχανισμός δράσης της TNF νευροπροστασίας αλλά και η επαλήθευση των ευρημάτων αυτών in vivo δεν έχει ακόμα αποδειχθεί, και είναι κάτι το οποίο μελετά η συγκεκριμένη διατριβή. Σε μία παράλληλη γραμμή έρευνας για τη νευροπροστατευτική δράση του TNF, προηγούμενες μελέτες του εργαστηρίου μας έχουν δείξει ότι, παρόμοια με τον TNF, προ-επώαση καλλιεργειών νευρώνων in vitro με υπερκείμενο καλλιέργειας μεσεγχυματικών βλαστοκυττάρων (ΜΒ) έχει νευροπροστατευτική δράση έναντι της επαγόμενης γλουταμινικής διεγερσιμοτοξικότητας. Τα ΜΒ έχουν αποδεδειγμένες θεραπευτικές και νευροπροστατευτικές ιδιότητες σε προκλινικό επίπεδο, σε μια σειρά από πειραματικά μοντέλα ασθενειών του ΚΝΣ, και ως εκ τούτου αποτελούν υποσχόμενο κυτταρικό εργαλείο για τη θεραπεία ανθρώπινων ασθενειών. Παρόλα αυτά, ο τρόπος δράσης των κυττάρων αυτών και η πιθανή εμπλοκή του TNF στη νευροπροστασία που επάγουν δεν έχει ακόμα αποσαφηνιστεί και είναι κάτι το οποίο επίσης μελετά η συγκεκριμένη διατριβή.Προκειμένου να απαντηθούν τα παραπάνω ερωτήματα, χρησιμοποιήθηκαν ποντικοί ελλειμματικοί ως προς τον TNF και τους υποδοχείς του τόσο σε ένα in vitro μοντέλο γλουταμινικού διεγερσιτοτοξικού θανάτου όσο και σε in vivo πειραματικά μοντέλα της ΣΚΠ. Το in vitro μοντέλο της γλουταμινικής, και συγκεκριμένα της NMDA- μεσολαβούμενης διεγερσιμοτοξικότητας, επιλέχτηκε λόγω του γεγονότος ότι αυξημένη συγκέντρωση του γλουταμινικού οξέος στον εγκέφαλο προκαλεί θάνατο των νευρώνων σε ένα μεγάλο εύρος νευροεκφυλιστικών διαταραχών, συμπεριλαμβανομένης της ΣΚΠ. Οι NMDA υποδοχείς, μαζί με τους AMPA και τους καϊνικούς υποδοχείς, ανήκουν στην οικογένεια των ιονοτρόπων γλουταμινικών υποδοχέων, οι οποίοι προσδένουν το γλουταμινικό οξύ, που είναι ένας βασικός διεγερτικός διαβιβαστής. Υπό ορισμένες προϋποθέσεις, διαταραχή της ισορροπίας του γλουταμινικού οξέος συντελεί στην εμφάνιση νόσων. Η υπερβολική ποσότητα γλουταμινικού οξέος είναι τοξική για τους νευρώνες, οι οποίοι οδηγούνται στο λεγόμενο διεγερσιτοτοξικό θάνατο, που προκαλείται από την εισροή ιόντων ασβεστίου μέσω των NMDA υποδοχέων.Αρχικά, επαληθεύτηκε η in vitro νευροπροστατευτική δράση του TNF έναντι της NMDA-μεσολαβούμενης διεγερσιμοτοξικότητας. Συγκεκριμένα, προ-επώαση μεικτών καλλιεργειών νευρώνων-αστροκυττάρων με solTNF είχε σαν αποτέλεσμα την προστασία των νευρώνων έναντι της NMDA-μεσολαβούμενης διεγερσιμοτοξικότητας. Παρόμοια προστασία παρατηρήθηκε και κατόπιν προ-επώασης καλλιεργειών νευρώνων με το υπερκείμενο καλλιέργειας μεσεγχυματικών βλαστοκυττάρων, που εν συνεχεία αναλύθηκε και βρέθηκε ότι περιέχει μεταξύ άλλων και μετρήσιμη συγκέντρωση TNF. Μάλιστα, εμπλουτισμός και προ-επώαση του υπερκείμενου των κυττάρων αυτών με ένα μη ειδικό αναστολέα του TNF, το etanecerpt, είχε σαν αποτέλεσμα τη μείωση της ικανότητάς του να προστατεύσει τους νευρώνες, προτείνοντας έτσι ότι η νευροπροστασία των MB μεσολαβείται εν μέρει από τον TNF που εκκρίνουν. Εν συνεχεία, χαρακτηρίστηκαν οι κυτταρικοί και μοριακοί μηχανισμοί με τους οποίους προ-επώαση καλλιεργειών νευρώνων του φλοιού με TNF οδηγεί σε νευροπροστασία έναντι της NMDA-μεσολαβούμενης διεγερσιμοτοξικότητας in vitro. Για το σκοπό αυτό, απομονώθηκαν αστροκύτταρα και νευρώνες από το φλοιό εγκεφάλου ποντικών, είτε αγρίου τύπου είτε ελλειμματικών ως προς τον TNF και τους υποδοχείς του, και συν-καλλιεργήθηκαν σε μεικτές καλλιέργειες νευρώνων- αστροκυττάρων διαφόρων γενετικών συνδυασμών. Προέκυψε ότι προ-επώαση μεικτών καλλιεργειών με εξωγενές solTNF ενεργοποιεί τα αστροκύτταρα, μέσω του TNFR1, τα οποία αυξάνουν την έκφραση τους σε tmTNF, το οποίο στη συνέχεια δρα νευροπροστατευτικά στους νευρώνες μέσω του TNFR2. Συγκεκριμένα, η σηματοδότηση μέσω του tmTNF των αστροκυττάρων και του TNFR2 των νευρώνων παρέχει νευροπροστασία έναντι του επαγόμενου NMDA-διεγερσιτοτοξικού θανάτου. Στη συνέχεια, μελετήθηκε ο ρόλος της TNF νευροπροστασίας in vivo, σε πειραματικά μοντέλα της ΣΚΠ. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκαν διαγονιδιακοί ποντικοί με κυτταρο-ειδική γονιδιακή έλλειψη του TNFR1, του TNFR2 ή της IKKβ κινάσης, συγκεκριμένα στους διεγερτικούς γλουταμινεργικούς νευρώνες, και μελετήθηκε η συμπεριφορά τους σε δύο πειραματικά μοντέλα της ΣΚΠ, στην πειραματική αυτοάνοση εγκεφαλομυελίτιδα (ΠΑΕ) και στο μοντέλο απομυελίνωσης μέσω κουπριζόνης. Η κινάση IKKβ ενεργοποιείται κατόπιν πρόσδεσης του TNF στον TNFR1 και οδηγεί στην ενεργοποίηση του μεταγραφικού παράγοντα NF-κΒ. Προέκυψε ότι, σε αντίθεση με τα in vitro αποτελέσματα, ο TNFR1 των νευρώνων προωθεί την έναρξη της κλινικής συμπτωματολογίας της ΠΑΕ, μέσω ενεργοποίησης της ΙΚΚβ κινάσης και του μεταγραφικού παράγοντα NF-κΒ. Επιπλέον, ο TNFR1 των νευρώνων αύξησε την απώλεια των ολιγοδενδροκυττάρων και την αξονική καταστροφή των νευρώνων του εγκεφάλου στο μοντέλο απομυελίνωσης μέσω κουπριζόνης. Από την άλλη πλευρά, η έλλειψη του TNFR2 από τους νευρώνες δε μετέβαλλε την ανάπτυξη ή την εξέλιξη της παθολογίας κανενός από τα δύο πειραματικά μοντέλα που εξετάστηκαν. Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι οι νευροπροστατευτικές δράσεις του TNF που παρατηρήθηκαν in vitro δεν είναι ικανές να προστατεύσουν τους ποντικούς έναντι της εξέλιξης της κλινικής συμπτωματολογίας και της νευροπαθολογίας στα μοντέλα της ΠΑΕ και της απομυελίνωσης μέσω κουπριζόνης, αντιστοίχως, και υποστηρίζουν την ανάγκη ανάπτυξης νέων θεραπευτικών στρατηγικών έναντι της ΣΚΠ, που να στοχεύουν ειδικά τον solTNF ή/και τον TNFR1.