Μελέτη παραγόντων της αγγειακής επασβέστωσης σε ασθενείς με διαβητική νεφροπάθεια

Abstract

Vascular calcification is highly prevalent in patients with chronic kidney disease (CKD) and predicts a variety of cardiovascular disease (CVD) events. CVD is the leading cause of morbidity and mortality in patients with kidney failure on dialysis, with a 30-fold higher mortality than the general population, despite adjustment for traditional CVD risk factors. Furthermore, type 2 diabetes mellitus (T2DM) patients present a high prevalence of CVD events due to accelerated vascular calcification, while the underlying pathogenic mechanisms are not completely understood. Thus, it is widely known that high calcification burden is seen in diabetic nephropathy (DN), even in early stages.Genetic and biochemical studies have established matrix Gla protein (MGP) as the first known protein that both in vitro and in vivo acts as a powerful calcification inhibitor. MGP is a vitamin K-dependent protein of 84 amino acids with a molecular weight of 12 kDa, expressed by hypertrophic chondrocytes and vascular smooth muscle cells in the arterial wall. The function of MGP depends on a post-translational γ-glutamyl carboxylation, an essential activation step that rely on the availability of vitamin K. Furthermore, to be fully biologically active, after γ-carboxylation, MGP must undergo phosphorylation on three serine residues. Vitamin K availability is maintained through the vitamin K cycle. In deficiency of vitamin K, MGP is neither carboxylated, nor phosphorylated and therefore remains inactive. The circulating, inactive dephosphorylated, uncarboxyalted form of MGP (dpucMGP) has been repeatedly associated with increased vascular calcification. Moreover, plasma levels of dpucMGP increased progressively with deterioration of renal function in a cohort of patients at different stages of CKD.Several studies have demonstrated that both dietary and genetic factors involved in a set of sequential reactions that guarantee recycling of vitamin K (the vitamin K cycle) can lead to poor vitamin K status and subsequently to reduced function of MGP. Single nucleotide polymorphisms (SNPs) in the key enzyme responsible for the recycling of vitamin K (VKORC1 -vitamin K epoxide reductase complex subunit 1) gene appear to be associated with accelerated calcification of the aorta. More detailed pharmacogenetic studies have demonstrated that carriers of the A allele of VKORC1 -1639G>A polymorphism presented higher function and levels of VKORC1 and subsequently increased vitamin K status and increased function of MGP. Another factor affecting the levels of vitamin K is apolipoprotein E (apoE), which plays an important role in receptor mediated clearance of lipoprotein particles-chylomicron (known carriers of vitamin K) from plasma. The gene encoding MGP has eight SNPs in its promoter and coding regions. Several studies have revealed the importance of the T-138C polymorphism, which lies in a region of the promoter that is essential for transcription in vascular smooth muscle cells.There is a growing body of evidence supporting that higher levels of dp-ucMGP, reflecting vitamin K insufficiency, are strong and independent predictors of adverse outcomes and increased risk for all-cause mortality and both fatal/non-fatal cardiovascular events in various groups of patients.We sought to determine the association between apoE, VKORC1 -1639G > A and MGP T-138C polymorphisms and the plasma levels of the inactive dpucMGP, as well as their effect on carotid intima-media thickness (cIMT) in patients with diabetic nephropathy. We also investigated the distribution of MGP T-138C polymorphism in this group of patients and the predictive value of dpucMGP and MGP T-138C polymorphism in relation to all- cause mortality, cardiovascular mortality and cardiovascular events in patients with DN.VKORC1 -1639G > A, apoE and MGP T-138C polymorphisms were determined by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) analysis in 40 diabetic patients without nephropathy and 118 patients at different stages of diabetic nephropathy including subjects on hemodialysis. Measurements of cIMT were performed using real-time B-mode ultrasonography. Plasma levels of dpucMGP were determined in a subgroup of 67 patients by ELISA.Mortality and cardiovascular events were assessed during a 7 year follow up. Plasma dpucMGP levels and cIMT values increased significantly with severity of diabetic nephropathy (P<0.0001 and P=0.004 respectively). DpucMGP levels were not associated with any of the three polymorphisms and cIMT. Although VKORC1-1639G> A and apoE polymorphisms were not associated with cIMT, MGP T-138C polymorphism was associated with cIMT in the total population. TT homozygotes for the MGP T-138C polymorphism had higher values of cIMT compared to combined TC and CC genotypes (P=0.006). MGP T-138C polymorphism was a strong independent predictor of cIMT (P<0.0001), after adjustment for several well-known atherosclerosis risk factors. MGP -138TT homozygotes were more frequent in the HD group versus CKD group and controls (P= 0.002). After adjustment for several risk factors, multivariate Cox analysis showed that compared to patients with TC and CC genotypes, subjects with TT genotype presented a significantly higher all-cause and cardiovascular mortality risk [Hazard Ratio (HR) 4.67, 95% Confidence Interval (CI) 1.37-15.94, P= 0.01 and HR 5.07, 95% CI 1.07-24.09, P= 0.04, respectively]. In the subgroup of 67 patients, multivariate Cox analysis showed that high plasma levels of dpucMGP >646 pM are independent risk factor for all-cause mortality [HR 2.97, 95% CI 1.27-6.95, P=0.012], CV mortality - (HR 5.49, 95% CI 1.85-16.33, P=0.002) and non-fatal CV event- (HR 2.07 95% CI 1.00-4.20, P=0.047). Since MGP is an important inhibitor of tissue and VC our study suggests that there may a genetic basis to tissue and VC in diabetic nephropathy.

Η Χρόνια Νεφρική Νόσος (ΧΝΝ) αποτελεί ένα σημαντικό επιδημιολογικό πρόβλημα, με αυξανόμενη συχνότητα και επιπολασμό και υψηλό κόστος στα εθνικά συστήματα υγείας, παγκοσμίως. Η κυριότερη αιτία της ραγδαίας αύξησης του επιπολασμού της νεφρικής νόσου την τελευταία εικοσαετία είναι η αύξηση του επιπολασμού του Σακχαρώδη Διαβήτη Τύπου 2 (ΣΔΤ2), της συχνότερης αιτίας της νεφροπάθειας. Στους ασθενείς με διαβητική νεφροπάθεια (ΔΝ), ακόμα και στα αρχικά στάδια, παρατηρείται επιταχυνόμενη επασβέστωση των αγγείων και συνεπώς η καρδιαγγειακή νόσος αποτελεί την πρώτη αιτία θνητότητας και νοσηρότητας.Η Matrix Gla Protein (MGP) αποτελεί την πρώτη πρωτεΐνη που αναγνωρίστηκε in vitro και in vivo ως ισχυρός αναστολέας αγγειακής επασβέστωσης (ΑΕ). Πρόκειται για μία βιταμινο-Κ εξαρτώμενη πρωτεΐνη 84 αμινοξέων, μοριακού βάρους 12 kDa, που εκφράζεται από τα χονδροκύτταρα και τα λεία μυϊκά κύτταρα του αγγειακού τοιχώματος. Για να γίνει βιολογικά δραστική η MGP πρέπει να υποστεί γ-καρβοξυλίωση και φωσφορυλίωση, διαδικασίες που εξαρτώνται από τις διαθέσιμη ποσότητα βιταμίνης Κ. Η ανενεργός, μη-καρβοξυλιωμένη, μη-φωσφορυλιωμένη μορφή της MGP (dpucMGP) έχει σχετιστεί επανειλημμένως με ανάπτυξη ΑΕ, αλλά και με εξέλιξη της ΧΝΝ.Αρκετές μελέτες έχουν δείξει πως εκτός από διαιτητικούς, εμπλέκονται και γενετικοί παράγοντες στον κύκλο της βιταμίνης Κ (ανακύκλωση της βιταμίνης Κ) και μπορούν να οδηγήσουν σε μειωμένη δραστικότητα της MGP και συνεπώς σε ΑΕ. Η υπομονάδα 1 του συμπλόκου της αναγωγάσης του εποξειδίου της βιταμίνης Κ (Vitamin K Epoxide Reductase Complex Subunit 1 – VKORC1) είναι βασικό συστατικό του κύκλου της βιταμίνης Κ, καθώς είναι το υπεύθυνο ένζυμο για την ολοκλήρωση της μετατροπής του εποξειδίου της βιταμίνης Κ σε βιταμίνη Κ και συνεπώς, της ανακύκλωσής της. Μονονουκλεοτιδικοί γονιδιακοί πολυμορφισμοί (single nucleotide polymorphisms, SNPs) στο γονίδιο που κωδικοποιεί το υπεύθυνο ένζυμο για την ανακύκλωση της βιταμίνης Κ έχουν συσχετιστεί με επιταχυνόμενη ΑΕ της αορτής. Στην περιοχή του υποκινητή του γονιδίου VKORC1 έχει ταυτοποιηθεί ο πολυμορφισμός -1639G>A. Φορείς του G αλληλομόρφου εμφανίζουν αυξημένη κατά 44% δραστικότητα του υποκινητή και αυξημένα επίπεδα ενζύμου VKORC1. Ένας άλλος παράγοντας που επηρεάζει τα επίπεδα της βιταμίνης Κ είναι η απολιποπρωτεϊνη Ε (apoE) η οποία διευκολύνει την κυτταρική πρόσληψη των χυλομικρών που αποτελούν το φορέα μεταφοράς της βιταμίνης Κ στο αίμα. Τα τρία συνηθισμένα αλληλόμορφα της apoE διαφέρουν στην ικανότητά τους να διευκολύνουν την κάθαρση των πλούσιων σε βιταμίνη Κ λιποπρωτεϊνών από την κυκλοφορία με αποτέλεσμα τα επίπεδα πλάσματος της βιταμίνης Κ να μεταβάλλονται στους φορείς των τριών αλληλομόρφων της apoE. Το γονίδιο που κωδικοποιεί την MGP έχει οκτώ SNPs στον υποκινητή και στις περιοχές κωδικοποίησης. O πολυμορφισμός T-138C (rs 1800802) βρίσκεται σε περιοχή του υποκινητή που είναι απαραίτητος για τη μεταγραφή στα λεία μυϊκά κύτταρα των αγγείων. Αρκετοί ερευνητές έχουν δείξει πως η κυκλοφορούσα dpucMGP είναι ανεξάρτητος παράγοντας κινδύνου για ολική και ΚΑ θνητότητα σε διάφορους πληθυσμούς.Στην παρούσα μελέτη, σε διαβητικούς ασθενείς με ΔΝ και σε διαβητικούς χωρίς ΔΝ, μετρήθηκαν τα επίπεδα της κυκλοφορούσας dpucMGP, το πάχος του Ε-ΜΧΚ -ως υποκλινικού δείκτη αθηροσκλήρωσης-, και εκτιμήθηκε η επίδραση γενετικών πολυμορφισμών των γονιδίων των MGP, VKORC1 και apoE σε σχέση με το πάχος του Ε-ΜΧΚ και τα επίπεδα της dpucMGP. Επίσης αξιολογήθηκε η επίδραση των παραπάνω παραγόντων στην ολική και ΚΑ θνητότητα, τα ΚΑ επεισόδια και την εξέλιξη της νεφρικής νόσου στον πληθυσμό αυτό.Η γονοτύπηση των πολυμορφισμών του VKORC1-1639G>A, της MGP -138 T>C και της apoE πραγματοποιήθηκε με τη μέθοδο PCR-RFLP (polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism) σε 40 ασθενείς με ΣΔΤ2 και φυσιολογική νεφρική λειτουργία (ομάδα ελέγχου) και 118 ασθενείς με διάφορα στάδια διαβητικής ΧΝΝ (1-5, συμπεριλαμβανομένων ασθενών υπό αιμοκάθαρση με τεχνητό νεφρό- ΤΝ). Τα επίπεδα της dp-ucMGP του πλάσματος υπολογίστηκαν με τη μέθοδο ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay). Σε όλους τους ασθενείς της μελέτης μετρήθηκε υπερηχογραφικά το πάχος του έσω-μέσου χιτώνα της κοινής καρωτίδας αρτηρίας (Ε-ΜΧΚ), με υψηλής ευκρίνειας υπερηχογραφικό μηχάνημα Doppler. Ο πληθυσμός της μελέτης παρακολουθήθηκε για μια 7ετία, με καταληκτικά σημεία την ολική θνητότητα, την ΚΑ θνητότητα και τα ΚΑ συμβάντα (θανατηφόρα και μη).Τα επίπεδα πλάσματος dpucMGP και η τιμή του πάχους Ε-ΜΧΚ σχετίστηκαν στατιστικά σημαντικά με την εξέλιξη της ΔΝ (P<0,0001 και P=0,004 αντιστοίχως). Η συγκέντρωση της dpucMGP ορού δε σχετίστηκε με κανέναν από τους τρεις πολυμορφισμούς ή το πάχος E-MXK. Ενώ οι πολυμορφισμοί VKORC1 -1639G > A και apoE δε σχετίστηκαν, ο πολυμορφισμός MGP T-138C σχετίστηκε με το πάχος του Ε-ΜΧΚ. Οι TT ομοζυγώτες εμφάνιζαν υψηλότερες πάχους Ε-ΜΧΚ συγκριτικά με τους γονότυπους TC και CC μαζί (P=0,006). Ο MGP T-138C ήταν ανεξάρτητος προγνωστικός παράγοντας του πάχους Ε-ΜΧΚ, μετά από προσαρμογή για αρκετούς παράγοντες κινδύνου για ΑΕ (P<0,0001). Επιπλέον, οι ομοζυγώτες ΤΤ εμφάνισαν μεγαλύτερη συχνότητα στην ομάδα των ασθενών υπό ΤΝ σε σύγκριση με την ομάδα της ΧΝΝ σταδίων 1-4 (P= 0,002). Κατόπιν προσαρμογής για αρκετούς παράγοντες κινδύνου, η πολυπαραγοντική ανάλυση Cox έδειξε πως οι ασθενείς με τον γονότυπο TT είχαν σχεδόν 5-πλάσιο κίνδυνο για ολική θνητότητα (Hazard Ratio -HR 4,67, 95% Confidence Interval -CI 1,37-15,94, P=0,01) και ΚΑ θνητότητα (HR 5,07, 95% CI 1,07-24,09, P=0,04) σε σχέση με τους ασθενείς που είχαν τους γονότυπους TC/CC. Στην υπο-ομάδα των ασθενών που μετρήθηκε η dpucMGP, η πολυπαραγοντική ανάλυση Cox έδειξε πως η υψηλή dpucMGP πλάσματος> 646 pM είναι ανεξάρτητος παράγοντας κινδύνου για ολική θνητότητα – [HR 2,97, 95% CI 1,27-6,95, P=0,012], KA θνητότητα - (HR 5,49, 95% CI 1,85-16,33, P=0,002) και εμφάνιση ΚΑ συμβάματος- (HR 2,07 95% CI 1,00-4,20, P=0,047) συγκριτικά με τους ασθενείς στην ομάδα της χαμηλής dpucMGP.Καθώς η MGP αποτελεί σημαντικό αναστολέα της ιστικής και αγγειακής επασβέστωσης, η μελέτη μας υποδεικνύει ότι μάλλον υπάρχει γενετική βάση στην επασβέστωση των ασθενών με διαβητική νεφροπάθεια. Θα μπορούσαμε να υποθέσουμε ότι ο πολυμορφισμός T-138C της MGP ίσως προδιαθέτει γενετικά στην έκφραση της αγγειακής επασβέστωσης.