Μεταβονομική μελέτη κυτταρικών σειρών διαφόρων τύπων καρκίνου και καρκινικών ιστών

Abstract

Over the last decades cancer is one of the main causes of death for the global population, with the most common types being lung, prostate, and colon cancer in men, and breast, colon, and cervical cancer in women. Adriamycin belongs to the general category of anthracyclines and it is an antineoplastic agent that is non-covalently bound to DNA. It has a large therapeutic range and so it has been widely used as a chemotherapeutic for more than 30 years, both on its own and in co-treatment schemes with other antineoplastic agents for the treatment of breast, ovarian, pancreatic, prostate, osteosarcoma and a number of other cancer types. Despite its potential for cancer cell destruction, adriamycin does not exhibit selectivity in its action, resulting in limitation of its use due to undesirable side effects, including cardiotoxicity and chemoresistance. Previous work carried out in our laboratory has highlighted the beneficial effect of co-treatment of adriamycin with oleuropein, a natural olive-derived product, which can improve the condition of myocardial tissue in normal laboratory animals. In the context of this thesis, the effect of adriamycin and its co-treatment with the antioxidant natural product oleuropein in cancer cell lines and in laboratory animals with cancer was studied. At the cellular level, prostate adenocarcinoma PC-3 and osteosarcoma of osteoblastic phenotype MG-63 were studied. Full-immune system mice were used as model laboratory animals and were inoculated with melanoma (B16.F1) and colon cancer (CT-26) cell lines. MTT cytotoxicity studies in PC-3 and MG-63 cancer cells have shown that co-treatment of adriamycin and oleuropein exhibits an inhibitory effect on the treatment of adriamycin. The cell cycle study showed that in both cell lines both adriamycin and co-treatment lead to cell accumulation in the G2/M phase of the cell cycle. The autophagy mechanism in the MG-63 cell line was tested by quantitating the expression levels of the p62 and NBR1 proteins. Significant alteration relative to the control sample was observed only for the p62 protein for the effects of adriamycin, oleuropein and co-treatment. The effect of co-treatment of adriamycin and oleuropein was also investigated via NMR based metabolomics. A statistical study and comparisons of the metabolic fingerprints of the PC-3 and MG-63 cancer cell lines, as well as of the cancerous tumors, liver, kidney and heart tissues of non-immunosuppressed mice, melanoma (B16.F1) and colorectal cancer (CT-26) xenografts were performed. The effect of gene modification of breast cancer cell line overexpressing the myc protein through metabolomics. The modification was made at exon 20 of the myc gene, and the study was performed in tumors grown in xenografts models from both cell lines, as well as in cell lines grown from the tumors. Adriamycin chemoresistance was investigated by means of the metabolomics in two osteosarcoma cell lines: the U2OS cell line with two chemoresistant sequences and the KHOS cell line for which three chemoresistant sequences have been developed. From the metabolomic analysis, a common group of metabolites emerged which appear in the cancer cell lines and tissues that were isolated and analyzed and appear to play a significant role in the onset and progression of cancer with most characteristic the glutamine, glutamic acid and UDP-N-Acetylglucosamine. The latter is the most interesting in our study as it relates to the biosynthetic pathway of hexosamine. In the case of the PC-3 cell line, all glycosylated proteins were determined by means of the Western blotting technique. The different treatments on cells modify glycosylated proteins, confirming the association with the hexosamine biosynthetic pathway (HBP pathway). The variations in UDP-N-Acetylglucosamine metabolite levels that were observed in several analyzed cell lines and tissues are very interesting and require further investigation.

Ο καρκίνος τις τελευταίες δεκαετίες αποτελεί μία από τις βασικές αιτίες θανάτου για τον παγκόσμιο πληθυσμό, με τους συχνότερα εμφανιζόμενους τύπους τον καρκίνο του πνεύμονα, του προστάτη, και του παχέος εντέρου στους άνδρες, και στις γυναίκες τον καρκίνο του μαστού, του παχέος εντέρου και του τραχήλου της μήτρας. Η αδριαμυκίνη ανήκει στη γενική κατηγορία των ανθρακυκλινών και αποτελεί αντινεοπλασματικό παράγοντα, ο οποίος συνδέεται με μη ομοιοπολικό τρόπο με το DNA. Παρουσιάζει μεγάλο θεραπευτικό εύρος γι’ αυτό χρησιμοποιείται ευρέως ως χημειοθεραπευτικό για περισσότερα από 30 χρόνια, τόσο μόνη της, όσο και σε σχήματα συγχορήγησης με άλλους αντινεοπλασματικούς παράγοντες στη θεραπεία του καρκίνου του μαστού, των ωοθηκών, του παγκρέατος, του προστάτη, στο οστεοσάρκωμα και σε πλήθος άλλων. Παρά τη δυναμική της στην καταστροφή των καρκινικών κυττάρων, η αδριαμυκίνη δεν εμφανίζει εκλεκτικότητα στη δράση της, με συνέπεια τον περιορισμό στην χρήση της εξαιτίας των ανεπιθύμητων παρενεργειών, με κυριότερες την καρδιοτοξικότητα και την χημειοανθεκτικότητα. Προηγούμενες εργασίες που έχουν πραγματοποιηθεί στο εργαστήριο έχουν αναδείξει την ευεργετική δράση της συγχορήγησης της αδριαμυκίνης με ένα φυσικό προϊόν προερχόμενο από την ελιά, την ολευρωπεΐνη, που μπορεί να βελτιώσει την κατάσταση του μυοκαρδιακού ιστού σε φυσιολογικά πειραματόζωα. Στα πλαίσια της παρούσας διδακτορικής διατριβής μελετήθηκε η επίδραση της αδριαμυκίνης και η συγχορήγησή της με το αντιοξειδωτικό φυσικό προϊόν ολευρωπεΐνη σε καρκινικές κυτταρικές σειρές και σε πειραματόζωα με καρκίνο. Σε κυτταρικό επίπεδο μελετήθηκαν οι κυτταρικές σειρές προστατικού αδενοκαρκινώματος PC-3 και οστεοσαρκώματος οστεοβλαστικού φαινοτύπου MG-63. Ως μοντέλα πειραματοζώων χρησιμοποιήθηκαν μύες με πλήρες ανοσοποιητικό σύστημα στους οποίους πραγματοποιήθηκε ενοφθαλμισμός με συγγενικές καρκινικές κυτταρικές σειρές μελανώματος (B16.F1) και παχέος εντέρου (CT-26). Οι μελέτες κυτταροτοξικότητας MTT στα καρκινικά κύτταρα PC-3 και MG-63, έδειξαν ότι η συγχορήγηση αδριαμυκίνης και ολευρωπεΐνης εμφανίζει ανασταλτική δράση σε σχέση με τη μονοχορήγηση της αδριαμυκίνης. Η μελέτη του κυτταρικού κύκλου έδειξε ότι και στις δύο κυτταρικές σειρές, τόσο η αδριαμυκίνη, όσο και η συγχορήγηση οδηγούν σε συσσώρευση των κυττάρων στη φάση G2/M του κύκλου. O μηχανισμός αυτοφαγίας στην κυτταρική σειρά MG-63 ελέγχθηκε μέσω της ποσοτικοποίησης των επιπέδων έκφρασης των πρωτεϊνών p62 και NBR1. Αξιόλογη διαφοροποίηση ως προς το δείγμα ελέγχου παρατηρήθηκε μόνο για την πρωτεΐνη p62 για τις επιδράσεις αδριαμυκίνη, ολευρωπεΐνη και συγχορήγηση. Η επίδραση της συγχορήγησης αδριαμυκίνης και ολευρωπεΐνης διερευνήθηκε επίσης με τη βοηθεια της μεταβονομικής βασισμένης στη φασματοσκοπία πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού (NMR). Έγινε στατιστική μελέτη και σύγκριση των μεταβολικών αποτυπωμάτων των καρκινικών κυτταρικών σειρών PC-3 και MG-63 αλλά και των ιστών καρκινικών όγκων, ήπατος, νεφρών και καρδιάς μη ανοσοκατεσταλμένων μυών, μοντέλων xenografts μελανώματος (B16.F1) και καρκίνου παχέος εντέρου (CT-26). Με τη βοήθεια της μεταβονομικής διερευνήθηκε η επίδραση γονιδιακής τροποποίησης κυτταρικής σειράς καρκίνου του μαστού που υπερεκφράζει την πρωτεΐνη myc. Η τροποποίηση έγινε στο εξόνιο 20 του γονιδίου της myc και η μελέτη πραγματοποιήθηκε σε όγκους που αναπτύχθηκαν σε μοντέλα xenografts από τις δύο κυτταρικές σειρές, αλλά και σε κυτταρικές σειρές που αναπτύχθηκαν από τους καρκινικούς όγκους. Η χημειοανθεκτικότητα έναντι της αδριαμυκίνης διερευνήθηκε με τη βοήθεια της μεταβονομικής σε δύο κυτταρικές σειρές οστεοσαρκώματος: την κυτταρική σειρά U2OS με δύο χημειοανθεκτικές σειρές και την κυτταρική σειρά KHOS για την οποία έχουν αναπτυχθεί τρεις χημειοανθεκτικές σειρές. Από το σύνολο των αναλύσεων της μεταβονομικής, προέκυψε μία κοινή ομάδα μεταβολιτών, οι οποίοι εμφανίζονται στις καρκινικές κυτταρικές σειρές και στους ιστούς που απομονώθηκαν και αναλύθηκαν και φαίνεται να διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στην έναρξη και την εξέλιξη του καρκίνου με πιο χαρακτηριστικούς τη γλουταμίνη, το γλουταμικό οξύ και τη Ν-Ακετυλογλουκοζαμίνη της διφωσφορικής ουριδίνης (UDP-N-Acetylglucosamine). Το τελευταίο είναι το πιο ενδιαφέρον στη μελέτη μας, καθώς σχετίζεται με το βιοσυνθετικό μονοπάτι της εξοζαμίνης. Στην περίπτωση της κυτταρικής σειράς PC-3 με τη βοήθεια της τεχνικής της ανοσοαποτύπωσης πρωτεϊνών κατά Western, προσδιορίστηκε το σύνολο των γλυκοζυλιωμένων πρωτεϊνών. Οι διαφορετικές επιδράσεις στα κύτταρα τροποποιούν τις γλυκοζυλιωμένες πρωτεΐνες, γεγονός που επιβεβαιώνει τη συσχέτιση με το μονοπάτι της βιοσύνθεσης της εξοζαμίνης (HBP pathway). Οι διαφοροποιήσεις που εμφανίζονται στα επίπεδα του μεταβολίτη UDP-N-Acetylglucosamine σε αρκετές από τις κυτταρικές σειρές και τους ιστούς που αναλύθηκαν είναι πολύ ενδιαφέρουσες και χρήζουν περαιτέρω έρευνας.