Περίληψη
Οι ευκαρυωτικοί διαμεμβρανικοί μεταφορείς ανταποκρίνονται σε περιβαλλοντικά και αναπτυξιακά σινιάλα τόσο στο μεταγραφικό όσο και στο μετα-μεταφραστικό επίπεδο. Η έκφραση των μεταφορέων ρυθμίζεται αυστηρά με την ταχεία de novoσύνθεση και στόχευση τους στη πλασματική μεμβράνη, αλλά και την ακόμη πιο ταχεία απομάκρυνσή τους από αυτήν μέσω της διαδικασίας της ενδοκύτωσης, ως απόκριση στην παρουσία ιόντων αμμωνίου ή περίσσειας υποστρώματος. Ο εκτενώς μελετημένος μεταφορέας ουρικού οξέος-ξανθίνης UapA του Aspergillus nidulansχρησιμοποιήθηκε για τη διερεύνηση τριών βασικών ερωτημάτων που σχετίζονται με τους μηχανισμούς που διέπουν την ενδοκυτταρική διακίνηση των μεταφορέων.Συγκεκριμένα, μελετήθηκαν οι συνέπειες του υπερτονικού στρες στην φυσιολογία των μυκήτων και την ενδοκύτωση των μεταφορέων τους, οι μηχανισμοί που ρυθμίζουν την ουβικουιτινίωση των μεταφορέων με σκοπό την απομάκρυνση τους από την πλασματική μεμβράνη και την καταστροφή τους στα χυμοτόπια, και ο ρόλος του ολιγομερισμού στην δ ...
Οι ευκαρυωτικοί διαμεμβρανικοί μεταφορείς ανταποκρίνονται σε περιβαλλοντικά και αναπτυξιακά σινιάλα τόσο στο μεταγραφικό όσο και στο μετα-μεταφραστικό επίπεδο. Η έκφραση των μεταφορέων ρυθμίζεται αυστηρά με την ταχεία de novoσύνθεση και στόχευση τους στη πλασματική μεμβράνη, αλλά και την ακόμη πιο ταχεία απομάκρυνσή τους από αυτήν μέσω της διαδικασίας της ενδοκύτωσης, ως απόκριση στην παρουσία ιόντων αμμωνίου ή περίσσειας υποστρώματος. Ο εκτενώς μελετημένος μεταφορέας ουρικού οξέος-ξανθίνης UapA του Aspergillus nidulansχρησιμοποιήθηκε για τη διερεύνηση τριών βασικών ερωτημάτων που σχετίζονται με τους μηχανισμούς που διέπουν την ενδοκυτταρική διακίνηση των μεταφορέων.Συγκεκριμένα, μελετήθηκαν οι συνέπειες του υπερτονικού στρες στην φυσιολογία των μυκήτων και την ενδοκύτωση των μεταφορέων τους, οι μηχανισμοί που ρυθμίζουν την ουβικουιτινίωση των μεταφορέων με σκοπό την απομάκρυνση τους από την πλασματική μεμβράνη και την καταστροφή τους στα χυμοτόπια, και ο ρόλος του ολιγομερισμού στην διακίνηση των μεταφορέων προς και από την πλασματική μεμβράνη. Xρησιμοποιώντας στελέχη του A. nidulans που εκφράζουν διαμεμβρανικούς μεταφορείς σημασμένους με την πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (GFP), μελετήσαμε(σε συνεργασία με τους Β. Μπίτσικα, Χ. Γουρνά και Γ. Διαλλινά) την άμεση εμφάνιση στατικών φθοριζουσών κηλίδων στο επίπεδο της πλασματικής τους μεμβράνης, μετά από έκθεση σε υπερτονικές συνθήκες. Οι φθορίζουσες κηλίδες που παρατηρήθηκαν δεν αντιστοιχούν σε μικροπεριοχές της μεμβράνης ειδικές για μεταφορείς, αλλά αντικατοπτρίζουν ένα μάλλον γενικό φαινόμενο που σχετίζεται με την αναδιοργάνωση της μεμβράνης. Αυτό φάνηκε από τον συνεντοπισμό τους με άλλα μόρια που σχετίζονται με τη πλασματική μεμβράνη, όπως το πεπτίδιο ομόλογο της πλεξτρίνης (PH) και η t-SNARE SsoA, ή με λιπόφιλους δείκτες, όπως η FM4-64 και η φιλιπίνη. Επιπλέον, οι κηλίδες αυτές δεν εμφανίζουν χαρακτηριστικά γνωρίσματα λιπιδικών σχεδιών ή άλλων μεμβρανικών μικροπεριοχών. Εικόνες από συνεστιακό μικροσκόπιο που έχουν επεξεργαστεί με αλγόριθμους αποαλληλεπικάλυψης(deconvolution) δείχνουν ότι οι φθορίζουσες αυτές κηλίδες αντιστοιχούν σε εκτεταμένες εγκολπώσεις της μεμβράνης. Οι μεταφορείς παραμένουν πλήρως λειτουργικοί κατά τη διάρκεια του φαινόμενου της εντοπισμένης πλασμόλυσης. Η εμφάνιση αυτών των εγκολπώσεων συνοδεύεται εντούτοις από μειωμένο ρυθμό ανάπτυξης και πλήρη παρεμπόδιση τόσο της ενδοκύτωσης των μεταφορέων μέσω κλαθρίνης, όσο και της ενδοκύτωσης ρευστής φάσης της FM4-64. Τα παραπάνω φαινόμενα είναι παροδικά και άμεσα αναστρέψιμα μετά την απομάκρυνση από το υπερτονικό περιβάλλον, ενώ εξαρτώνται άμεσα από τη συγκέντρωση των υπερτονικών διαλυμάτων που έχουν χρησιμοποιηθεί. Το υπερτονικό στρες δεν επηρέασε την τοπολογία πρωίμων (SlaB)και όψιμων (AbpA) ενδοκυτικών παραγόντων, αλλά τροποποίησε σε μεγάλο βαθμό την τοπολογία της τροπομυοσίνης, υποδεικνύοντας ότι η παρεμπόδιση της ενδοκύτωσης των μεταφορέων και των λιπόφιλων χρωστικών γίνεται έμμεσα, μέσω δυναμικής τροποποίησης της ακτίνης. Παράλληλα, η δράση της λατρουνκουλίνης Β στην ενδοκύτωση, ενός παράγοντα αποπολυμερισμού της ακτίνης, ενίσχυσε περαιτέρω τις παραπάνω παρατηρήσεις. Παρόμοια φαινόμενα παρατηρήθηκαν και στον Saccharomyces cerevisiae, γεγονός που υποδεικνύει ότι οι ασκομύκητες αποκρίνονται στις υπερτονικές συνθήκες χρησιμοποιώντας παρόμοιουςμηχανισμούς.Προκειμένου να διαλευκανθούν οι μηχανισμοί που ρυθμίζουν την ουβικουιτινίωση των μεταφορέων και την απομάκρυνση τους από τη μεμβράνη,μελετήσαμε (σε συνεργασία με τους Σ. Αμίλλη, Μ. Ευαγγελινό, Α. Κοκοτό, Β.Γιαλελή και Γ. Διαλλινά) το ρόλο όλων των πρωτεϊνών που ομοιάζουν με αρρεστίνες του Aspergillus nidulans, σχετικά με την ανάπτυξη, τη μορφολογία, την ευαισθησία του οργανισμού σε φάρμακα, και κυρίως την ενδοκύτωση του μεταφορέα UapA. Μία μόνο αρρεστίνη, η ArtA, βρέθηκε να είναι απαραίτητη γιατ ην εξαρτώμενη από τη HulARsp5 ουβικουιτινίωση και ενδοκύτωση του UapA, ως απόκριση στην παρουσία αμμωνιακών ιόντων ή υποστρωμάτων. Περαιτέρω γενετική ανάλυση έδειξε ότι τα κατάλοιπα 545-563 του καρβοξυτελικού άκρου τουUapA, που περιλαμβάνουν και ένα σημαντικό δισόξινο μοτίβο, είναι απαραίτητα για την ενδοκύτωση του, γεγονός που υποδεικνύει ότι αυτή ενδεχομένως είναι η περιοχή αλληλεπίδρασης της αρρεστίνης και του μεταφορέα. Επιπλέον, τα PPXY μοτίβα τουArtA είναι απαραίτητα και επαρκή για την ουβικουιτινίωση και την ενδοκύτωση τουUapA. Η δράση της ArtA εντοπίζεται πριν από αυτήν του όψιμου ενδοκυτικού παράγοντα SagAEnd3, υποδεικνύοντας ότι η ουβικουιτινίωση του UapA λαμβάνει χώρα στην πλασματική μεμβράνη και όχι στα ενδοσώματα. Η ArtA ουβικουιτινιώνεται επίσης από τη HulA στη λυσίνη 343 και αυτή η τροποποίηση είναι σημαντική για την ουβικουιτινίωση και την ενδοκύτωση του UapA. Η ArtA είναι απαραίτητη για την ενδοκύτωση και άλλων μεταφορέων ειδικών για πουρίνες(AzgA) και L-προλίνη (PrnB), αλλά όχι για το μεταφορέα ασπαρτικού/γλουταμικού(AgtA). Είναι αξιοσημείωτο ότι τα δεδομένα που έχουμε στη διάθεσή μας υποδεικνύουν ότι το ενδοκυτικό μονοπάτι που επάγεται από την παρουσία ιόντων αμμωνίου είναι διαφορετικό από αυτό που ακολουθείται υπό την παρουσία περίσσειας υποστρώματος. Το δεύτερο μονοπάτι, μάλιστα, φαίνεται να εξαρτάται άμεσα από τις δομικές αλλαγές που υφίσταται το μόριο του UapA κατά την κατάλυση της μεταφοράς.Τα παραπάνω συμφωνούν με προηγούμενες παρατηρήσεις που έδειξαν ότι η ενδοκύτωση που επάγεται από την παρουσία περίσσειας υποστρώματος λαμβάνει χώρα μόνο εφόσον τα μόρια του μεταφορέα είναι λειτουργικά. Εντούτοις,μεταλλαγμένες ανενεργές μορφές του UapA μπορούν να ενδοκυτωθούν in transόταν εκφράζονται παράλληλα με λειτουργικές μορφές του μεταφορέα στο ίδιο στέλεχος, το οποίο αποτελεί μια ένδειξη ότι ο UapA ολιγομερίζεται. Ο ολιγομερισμός του UapA επιβεβαιώθηκε χρησιμοποιώντας δύο ξεχωριστές προσεγγίσεις: την in vivo διμοριακή ανασύσταση φθορισμού (BiFC) και την παράλληλη ανοσοκατακρήμνιση διαφορικά σημασμένων UapA μορίων (pull-downassay). Επιπλεόν, γενετικά δεδομένα που δείχνουν αλληλοεξαρτώμενη δράση ανενεργών UapA μορίων στην ενεργότητα μεταφορέων αγρίου τύπου, συμφωνούν με την ιδέα του ολιγομερισμού. Τα ολιγομερή του UapA φαίνεται να σχηματίζονται πρώτα στο ενδοπλασματικό δίκτυο (ΕΔ) και παραμένουν σταθερά και λειτουργικά στην πλασματική μεμβράνη. Η χρήση μεταλλαγμένων μορφών του UapA που παραμένουν στο ΕΔ συνέβαλε στον προσδιορισμό ενός αμινοτελικού μοτίβου καθώς και άλλων στοιχείων που επηρεάζουν τον ολιγομερισμό. Ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός ότι η επαγόμενη από το υπόστρωμα ενδοκύτωση φαίνεται να συμπίπτει με τον απο-ολιγομερισμό του μεταφορέα, κάτι που δεν ισχύει στην περίπτωση της ενδοκύτωσης που επάγεται από τα αμμωνιακά ιόντα. Όλα τα παραπάνω ευρήματα υποδεικνύουν ότι ο ολιγομερισμός του UapA είναι σημαντικός για την έξοδο του από το ΕΔ, τη στόχευσή του στη πλασματική μεμβράνη αλλά και την ενδοκύτωσή του, όπως άλλωστε έχει δειχθεί και για μεταφορείς στα φυτά και τα θηλαστικά.
περισσότερα
Περίληψη σε άλλη γλώσσα
Eukaryotic transporters respond to environmental and developmental signals at boththe transcriptional and post-translational levels. Their tight control includes rapid denovo synthesis and targeting to the plasma membrane (PM) and even more rapiddown-regulation through endocytosis and vacuolar degradation, triggered by NH4+orexcess substrate. The extensively studied uric acid-xanthine transporter UapA ofAspergillus nidulans was used to address three questions concerning the mechanismsunderlying intracellular trafficking of transport proteins: what are the effects ofhypertonicity in fungal physiology and transporter endocytosis, which are themechanisms regulating transporter ubiquitination and turnover, and what is the roleof transporter oligomerization in membrane trafficking and endocytosis.In particular, A. nidulans strains expressing GFP-tagged transporters were usedto study the rapid appearance of cortical, relatively static, fluorescent patches inresponse to hypertonic treatment ( ...
Eukaryotic transporters respond to environmental and developmental signals at boththe transcriptional and post-translational levels. Their tight control includes rapid denovo synthesis and targeting to the plasma membrane (PM) and even more rapiddown-regulation through endocytosis and vacuolar degradation, triggered by NH4+orexcess substrate. The extensively studied uric acid-xanthine transporter UapA ofAspergillus nidulans was used to address three questions concerning the mechanismsunderlying intracellular trafficking of transport proteins: what are the effects ofhypertonicity in fungal physiology and transporter endocytosis, which are themechanisms regulating transporter ubiquitination and turnover, and what is the roleof transporter oligomerization in membrane trafficking and endocytosis.In particular, A. nidulans strains expressing GFP-tagged transporters were usedto study the rapid appearance of cortical, relatively static, fluorescent patches inresponse to hypertonic treatment (in collaboration with V. Bitsikas, C. Gournas andG. Diallinas). Patch formation is not a transporter-specific effect, but rather reflectsglobal membrane reorganization. This was shown by co-localization with otherplasma membrane-associated molecules, such as a pleckstrin homology (PH) domainand the SsoA t-SNARE, or the lipophilic markers FM4-64 and filipin. Moreover,patches did not show characteristics of lipid rafts or any other membranemicrodomains. Accordingly, deconvoluted microscopic images showed thatfluorescent patches correspond to PM invaginations. Transporters remain fully activeduring this phenomenon of localized plasmolysis. Plasmolysis is, however,associated with reduced growth rate and a dramatic blockage of both clathrinmediatedendocytosis of transporters and fluid-phase internalization of FM4-64.These phenomena are concentration-dependent, transient and rapidly reversible uponwash-out of hypertonic media. Blockage of endocytosis by hypertonicity did not affect the cortical appearance of upstream (SlaB) or downstream (AbpA) endocyticmarkers, but dramatically modified the subcellular localization of tropomyosin,suggesting that hypertonicity acts indirectly on endocytosis by modifying actindynamics. This was further supported by the effect of latrunculin B, an actindepolymerization agent, on endocytosis. Hypertonic conditions elicited similarphenomena in Saccharomyces cerevisiae, which suggests that they constitute basichomeostatic responses of ascomycetes to hypertonic stress. In order to elucidate the mechanisms regulating transporter ubiquitination andinternalization from the PM, the role of all arrestin-like proteins of A. nidulans wasinvestigated in respect to growth, morphology, sensitivity to drugs and specificallyfor UapA turnover. A single arrestin, ArtA, was found to be essential for HulARsp5-dependent ubiquitination and endocytosis of UapA in response to either NH4+or substrates (in collaboration with S. Amillis, M. Evangelinos, A. Kokotos, V. Yalelisand G. Diallinas). Mutational analysis showed that residues 545-563 of the UapA Cterminalregion, which includes a critical di-acidic motif, are required for efficientUapA endocytosis, thus suggesting that this might be the interaction interfacebetween the arrestin and the transporter. Furthermore, PPXY motifs of ArtA areessential and sufficient for UapA ubiquitination and endocytosis. ArtA functionsupstream from the late endocytic factor SagAEnd3, indicating that UapAubiquitination takes place in the PM rather than in an early endosomal compartment.ArtA is itself ubiquitinated by the same ubiquitin ligase (HulA) at residue Lys343and this modification is critical for the efficiency of UapA ubiquitination andendocytosis. ArtA is also essential for vacuolar turnover of transporters specific forpurines (AzgA) or L-proline (PrnB), but not for an aspartate/glutamate transporter(AgtA). Notably, evidence presented herein indicates that NH4+-induced andsubstrate-elicited endocytosis occur via two distinct pathways and the latter isdependent on conformational changes of UapA associated with transport catalysis.This is consistent with previous observations showing that substrate-inducedendocytosis operates only for functional UapA molecules. However, inactive UapAversions can be endocytosed in trans when co-expressed with active ones, an indication that UapA homo-oligomerizes. Oligomerization of UapA was confirmedusing two different approaches: in vivo bimolecular fluorescence complementation(BiFC) and direct pull-down assays of differentially tagged UapA molecules. It wasalso supported by genetic evidence showing an apparent dominant-negative effect ofinactive mutants on the activity of wild-type UapA. UapA oligomers seem to beinitially formed in the ER and remain stable and functional in the PM. Using UapAshowing ER-retention mutants, an N-terminal motif and other elements affectingoligomerization were identified. Interestingly, substrate-elicited endocytosis, unlikeNH4+-induced, seems tocoincide with the dissociation of transporter oligomers priorto internalization. Therefore, UapA oligomerization, analogously to some plant andmammalian transporters, is critical for ER-exit, sorting to the PM and endocytosis.
περισσότερα