A study of membrane protein trafficking, endocytosis and degradation through the development of new genetic and biochemical tools

Abstract

In eukaryotic cells, transmembrane proteins are co-translationally inserted in the lipid bilayer of the Endoplasmic Reticulum (ER). In order for these proteins to exit the ER packaged in COPII vesicles, both ER-exit motifs and interacting regulatory proteins that ensure proper cargo folding, are required. Following ER-exit, transmembrane proteins are trafficked through the Golgi network, packaged in vesicles and targeted to their final subcellular destination (plasma membrane, endosomal, mitochondrial, vacuolar etc) where they are integrated in the correct lipid bilayer. Additionally, polar cells such as neurons, muscle cells or filamentous fungi (e.g. Aspergillus) utilize cellular mechanisms that control the targeting and topology of each protein to distinct areas of the plasma membrane. The homeostasis of cellular function depends, largely, on the continuous movement of molecules between the subcellular compartments. Several steps of this intracellular protein trafficking implicate specific coated-vesicle formation and transport on microtubules (MTs), which function as tracks in a process propelled by their associated motor proteins (kinesin, dynein). Adaptor protein complexes (APs) are important for the formation of clathrin-coated vesicles for most eukaryotes, whereas all three fungal AP complexes are universally conserved (AP-1, AP-2 and AP-3). They play key roles in the selection, traffic, endocytosis and recycling of membrane cargoes, whilst the presence of functional adaptors and clathrin is indispensable for the homeostasis and survival of eukaryotic cells. Interestingly however, in light of the discoveries of the past 10 years, the existence of specialized clathrin-independent trafficking pathways has also been proposed. Transporters and apically localized cargoes, are two of the most important categories of transmembrane proteins, that participate in processes necessary for normal development. In this thesis, we study protein dimerization prior to ER-exit and investigate the role of AP complexes in transmembrane protein trafficking to the plasma membrane, but also in their rapid removal via endocytosis, as well as the role of clathrin in these processes, through the development of new genetic and biochemical tools. The filamentous fungus Aspergillus nidulans has emerged as unique, genetically tractable, system to study protein trafficking via its amenability to in vivo epifluorescence and multidimensional microscopy. The extensively studied uric acid/xanthine symporter, UapA, is used as a model cargo for studying the mechanisms of intracellular trafficking of fungal transporters, and for investigating the role of dimer formation in ER-exit. Additionally, selected apical markers are used to investigate the general trafficking pathways in which AP complexes are implicated. More specifically, we elucidate the role of AP-1 in cargo trafficking and show that it is essential for growth due to its involvement in microtubule-based movement of vesicles towards the apex of growing hyphae. Furthermore, we identify clathrin-binding motifs in the C-terminal region of the β1 subunit, and we provide evidence that AP-1 is involved in both anterograde sorting of RabE-labeled secretory vesicles and RabA/B-dependent endosome recycling. Additionally, AP-1 is shown to be critical for microtubule and septin organization, further rationalizing its essentiality in cells that face the challenge of cytoskeleton-dependent polarized cargo traffic. We also show that AP-2 has a clathrin-independent essential role in polarity maintenance and growth of A. nidulans, which was in line with experiments showing that AP-2 does not co-localize with clathrin. We provide genetic and cellular evidence that AP-2 interacts with endocytic markers SlaB/End4 and SagA/End3 and, most importantly, the lipid flippases DnfA and DnfB, specifically in the sub-apical collar region of growing hyphae. The role of AP-2 in the maintenance of proper apical membrane lipid and cell wall composition is further supported by its functional interaction with proteins/enzymes necessary for sphingolipid biosynthesis, apical sterol-rich membrane domains formation and chitin deposition. Our findings sugggest, for the first time, that the AP-2 complex of higher fungal groups, including the most threatening fungal pathogens, has acquired, in the course of evolution, a specialized clathrin-independent function necessary for fungal polar growth. Through this work, we gain insight on the mechanisms underlying the polarized mode of life of eukaryotic cells, with potential applications to mammalian polarized cells, such as neurons. Furthermore, given the utmost importance of membrane trafficking in cell survival, new pathways are emerging in finding targeted approaches to pathogenic fungi.

Οι διαμεμβρανικές πρωτεΐνες στα ευκαρυωτικά κύτταρα ενσωματώνονται στη μεμβράνη του Ενδοπλασματικού Δικτύου (ΕΔ) συμμεταφραστικά. Προκειμένου να εξέλθουν από το ΕΔ με κυστίδια τύπου COPII, απαιτείται μία σειρά ελέγχων που αφορά τόσο παράγοντες που εντοπίζονται στο πρωτεϊνικό μόριο, όπως για παράδειγμα η παρουσία συντηρημένων μοτίβων εξόδου από το ΕΔ, όσο και η αλληλεπίδραση με ρυθμιστικές πρωτεΐνες που διασφαλίζουν τη σωστή αναδίπλωση του μορίου. Μετά την έξοδο από το ΕΔ, οι πρωτεΐνες διακινούνται μέσω του Golgi δικτύου, πακετάρονται σε κυστίδια, μεταφέρονται στον τελικό τους υποκυτταρικό προορισμό (πλασματική μεμβράνη και μεμβράνες οργανιδίων) και ενσωματώνονται στην κατάλληλη μεμβράνη. Επίσης, πολικά ευκαρυωτικά κύτταρα, όπως οι νευρώνες, τα μυϊκά ή οι παθογόνοι νηματοειδείς μύκητες (πχ. Aspergillus) διαθέτουν μηχανισμούς που διαφοροποιούν την στόχευση και τοπολογία κάθε πρωτεΐνης σε διακριτά σημεία της πλασματικής μεμβράνης. H εύρυθμη κυτταρική λειτουργία βασίζεται επίσης στη συνεχή μετακίνηση μορίων μεταξύ των διάφορων υποκυτταρικών οργανιδίων. Σε αρκετά βήματα αυτής της ενδοκυτταρικής κυκλοφορίας, συμμετέχουν ειδικά μεταφορικά ‘καλυμμένα’ κυστίδια τα οποία μεταφέρονται κατά μήκος των μικροσωληνίσκων σε μια διαδικασία βάδισης που διεξάγεται από σχετιζόμενες κινητήριες πρωτεΐνες (κινεσίνη, δυνεΐνη). Τα πρωτεϊνικά σύμπλοκα προσαρμογής (Αdaptor Proteins, APs) φαίνεται να κατέχουν εξέχοντα ρόλο για τη δημιουργία κυστιδίων με κάλυμμα κλαθρίνης, στους περισσότερους ευκαρυωτικούς οργανισμούς, ενώ τα τρία μυκητιακά AP σύμπλοκα εμφανίζουν υψηλή ομολογία με τα αντίστοιχα των υπόλοιπων ευκαρυωτών (AP-1, AP-2, AP-3). Κατέχουν βασικό ρόλο στην επιλογή, διακίνηση, ενδοκύτωση και ανακύκλωση διαμεμβρανικών φορτίων, ενώ τόσο η παρουσία λειτουργικών υπομονάδων αυτών, όσο και της ίδιας της κλαθρίνης έχει αναδειχθεί ως απαραίτητη για την ομοιόσταση και επιβίωση των κυττάρων. Ωστόσο, υπό το φως ανακαλύψεων των τελευταίων 10 ετών υπάρχει εξαιρετικά έντονο επιστημονικό ενδιαφέρον, που αφορά στην ύπαρξη και ανεξαρτήτων της κλαθρίνης, μονοπατιών διακίνησης πρωτεϊνών. Από τις πιο σημαντικές διαμεμβρανικές πρωτεΐνες είναι οι μεταφορείς υδατοδιαλυτών ουσιών και οι πρωτεΐνες που εμφανίζουν πολική εναπόθεση και συμμετέχουν σε διαδικασίες απαραίτητες για τη φυσιολογική ανάπτυξη του οργανισμού. Στη διατριβή αυτή μελετάται η σημασία του διμερισμού πριν την έξοδο από το ΕΔ και διερευνάται η συμμετοχή των AP συμπλόκων στη στόχευση των διαμεμβρανικών πρωτεϊνών στην πλασματική μεμβράνη, αλλά και στην ακόμη πιο ταχεία απομάκρυνσή τους από αυτήν μέσω της διαδικασίας της ενδοκύτωσης, καθώς και ο ρόλος της κλαθρίνης σε αυτές τις διαδικασίες, μέσω της ανάπτυξης νέων γενετικών και βιοχημικών προσεγγίσεων. Ο νηματοειδής μύκητας Aspergillus nidulans, έχει αναδειχθεί ως μοναδικό σύστημα μελετών όπου εφαρμόζονται συνδυαστικές προσεγγίσεις γενετικής και μικροσκοπίας επιφθορισμού. Ο εκτενώς μελετημένος μεταφορέας ουρικού οξέος-ξανθίνης, UapA, χρησιμοποιήθηκε ως το βασικό μόριο για τη διερεύνηση βασικών ερωτημάτων που σχετίζονται με τους μηχανισμούς που διέπουν την ενδοκυτταρική διακίνηση των μεταφορέων και το ρόλο του διμερισμού στην έξοδο από το ΕΔ, ενώ συγκεκριμένες πρωτεΐνες που εμφανίζουν πολική κατανομή στην κορυφαία περιοχή της πλασματικής μεμβράνης χρησιμοποιήθηκαν ως μόρια για τη μελέτη των γενικών μονοπατιών διακίνησης στα οποία εμπλέκονται τα AP σύμπλοκα. Συγκεκριμένα, διερευνούμε το ρόλο του AP-1 συμπλόκου στη διακίνηση φορτίων και δείχνουμε ότι είναι απαραίτητο για την αύξηση, λόγω της συμμετοχής του στη μετακίνηση κυστιδίων μέσω μικροσωληνίσκων, προς την κορυφαία περιοχή της αναπτυσσόμενης υφής. Ακόμη, ταυτοποιούμε μοτίβα δέσμευσης της κλαθρίνης στην καρβοξυτελική περιοχή της β1 υπομονάδας και παρέχουμε αποδείξεις για την εμπλοκή του AP-1 τόσο στην ορθόδρομη μεταφορά εκκριτικών κυστιδίων που περιέχουν το RabE, όσο και στην ανάδρομη, εξαρτώμενη από τα RabA/RabB, ανακύκλωση ενδοσωμάτων. Επίσης δείχνουμε πως το AP-1 είναι σημαντικό για την οργάνωση των μικροσωληνίσκων και των σεπτινών, ερμηνεύοντας έτσι την αναγκαιότητα του για τα κύτταρα που αντιμετωπίζουν την πρόκληση της εξαρτώμενης από τον κυτταροσκελετό, πολικής αύξησης. Μελετάμε επίσης τον ρόλο του AP-2 συμπλόκου, ο οποίος φαίνεται πως είναι ανεξάρτητος τοπολογικά και λειτουργικά από αυτόν της κλαθρίνης και σχετίζεται με τη διατήρηση της πολικής αύξησης στον A. nidulans. Παρέχουμε ακόμη κυτταρικές και γενετικές αποδείξεις πως το AP-2 αλληλεπιδρά με τους παράγοντες ενδοκύτωσης SlaB/End4 και SagA/End3 καθώς και τις λιπιδικές φλιππάσες, DnfA και DnfB, στην περιοχή συνεχούς ενδοκύτωσης των αναπτυσσόμενων υφών. Ο ρόλος του AP-2 στη διατήρηση της φυσιολογικής λιπιδικής σύστασης της κορυφαίας μεμβράνης και του κυτταρικού τοιχώματος, ενισχύεται από την αλληλεπίδρασή του με ένζυμα/πρωτεΐνες απαραίτητα για τη βιοσύνθεση σφιγγολιπιδίων, για το σχηματισμό λιπιδικών περιοχών πλούσιων σε στερόλη και για τη φυσιολογική εναπόθεση χιτίνης. Τα ευρήματα μας αποδεικνύουν, για πρώτη φορά, την ύπαρξη ενός μονοπατιού ενδοκυτταρικής μεταφοράς των πιο εξελιγμένων μυκήτων που λειτουργεί βασιζόμενο αποκλειστικά στην ύπαρξη του AP-2 συμπλόκου, χωρίς τη συμβολή κλαθρίνης. Το σύνολο της διατριβής αυτής συνεισφέρει σημαντικά στην πρόωθηση της γνώσης που αφορά στην κατανόηση της λειτουργίας των ευκαρυωτικών κυττάρων τα οποία εμφανίζουν πολική αύξηση, με πιθανές προεκτάσεις και σε πολικά κύτταρα ανώτερων θηλαστικών, όπως οι νευρώνες. Ακόμη, δεδομένης της υψίστης σημασίας της μεμβρανικής διακίνησης στην εύρυθμη λειτουργία των κυττάρων, ανοίγονται νέοι δρόμοι στη εύρεση στοχευμένων προσεγγίσεων αντιμετώπισης παθογόνων μυκήτων.