Development of state-of-the-art mass spectrometry-based analytical methodologies for the study of bioactive natural products fate after dietary administration: bioavailability, metabolism/metabolomics studies

Abstract

Flavonoids are a class of polyphenolic molecules present in food, such asfruits, vegetables and plant derived juices. They represent one of the mostimportant classes of biologically active compounds.In the present study the fate as well as the putative biochemical effects ofnaringin and hesperidin was examined after their dietary supplementation inRoss 308 broiler chickens, in order to increase the antioxidant capacity oftheir tissues.Two fully validated methodologies were developed for the simultaneousquatitation of hesperidin, naringin, hesperetin and naringenin in plasma andtissue samples. According to the results, in plasma samples only naringinconcentration levels were above the LLOQ after 30 days of administrationwhereas in tissue samples no detectable amounts have been discovered.Due to the low concentration levels of the analytes in plasma a HighResolution Mass Spectrometry based metabolism study was performed inorder to examine the possibility of rapid and extensive metabolism. Twometabolite modifications were detected for naringin, for naringenin and forhesperidin, respectively. Nevertheless, no metabolite modification wasdetected for hesperetin. Into the next step, the effect of the substances in the whole biochemicalprofile of the organism has been investigated. Due to the complexity of suchanalyses, novel data processing methologies have to be developed andvalidated. In theis context, a new strategy in the data processing pipeline ofMS based metabolomics was developed with the aim to increase the numberof the reliable metabolite identifications. This methodology was applied to theuntargeted metabolomics study in chicken plasma samples that wereadministered either with hesperidin or naringin for 30 days. Four variableswere detected to discriminate control group from the group after naringinadministration whereas only one substance could effectively discriminate thehesperidin treated from the control group. Additionally in order to further characterize the metabolic changes that occurin tissues as a response to naringin and hesperidin dietary supplementation inchickens, two metabolomics studies (for naringin and hesperidin) has beenheld. Six variables were detected as discriminating naringin the dietarysupplementation group and twelve variables corrresponding hesperidinsupplementation group from their respective control group.

Τα φλαβονοειδή είναι μια κατηγορία πολυφαινολικών μορίων που περιέχονται σε τρόφιμα, όπως φρούτα, λαχανικά και παράγωγα φυτικών χυμών.Αντιπροσωπεύουν μία από τις πιο σημαντικές κατηγορίες βιολογικών ενώσεων με ενδιαφέρουσα δράση.Στην παρούσα εργασία, εξετάστηκε η τύχη και οι βιοχημικές επιδράσεις της ναργινίνης και εσπεριδίνης μετά τη χορήγηση τους μέσω της τροφής σε Ross308 κοτόπουλα, μελετώντας την αύξηση της αντιοξειδωτικής ικανότητα τους στους ιστούς.Δύο πλήρως επικυρωμένες μεθοδολογίες αναπτύχθηκαν για την ταυτόχρονη ποσοτικοποίηση της εσπεριδίνης, ναργινίνης, εσπερετίνης και ναριγενίνης σε δείγματα πλάσματος και ιστών. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα, στα δείγματα πλάσματος μόνο τα επίπεδα συγκέντρωσης της ναργινίνης ήταν πάνω από το κατώτατο όριο ποσοτικοποίησης (LLOQ) μετά από 30 ημέρες χορήγησης,ενώ στα δείγματα ιστών δεν ανιχνεύτηκαν οι ουσίες.Λόγω των χαμηλών επιπέδων συγκέντρωσης των ουσιών στο πλάσμα,διεξήχθη μελέτη μεταβολισμού βασιζόμενη σε υψηλής ανάλυσης φασματομετρία μάζας, με σκοπό να μελετηθεί η πιθανότητα γρήγορου κι εκτεναμένου μεταβολισμού των ουσιών. Δύο μεταβολικές τροποποιήσεις εντοπίστηκαν για τη ναργινίνη, ναριγενίνη και εσπεριδίνη, αντίστοιχα. Καθώς και καμία μεταβολική τροποποίηση δεν ανιχνεύθηκε για την εσπερετίνη. Στο επόμενο στάδιο, διερευνήθηκε η επίδραση των ουσιών στο ολικό βιοχημικό προφίλ του οργανισμού. Λόγω της πολυπλοκότητας των αναλύσεων αυτών, κρίνεται αναγκαία η ανάπτυξη και η επικύρωση καινούργιων μεθοδολογιών επεξεργασίας των δεδομένων. Κάτω από αυτό το πλαίσιο, μια νέα στρατηγική για την επεξεργασία των μεταβολομικών δεδομένων από φασματόμετρο μάζας αναπτύχθηκε, με στόχο να αυξηθεί ο αριθμός των μεταβολιτών που ανιχνεύονται με αξιοπιστία. Αυτή η μεθοδολογία εφαρμόστηκε στη μεταβολομική μελέτη των δειγμάτων πλάσματος κοτόπουλου, στα οποία χορηγήθηκαν εσπεριδίνη ή ναργινίνη για 30 ημέρες. Τέσσερις μεταβλητές εμφανίστηκαν να διαχωρίζουν την ομάδα ελέγχου από την ομάδα χορήγησης της ναργινίνης, ενώ μόνο μία μεταβλητή συνέβαλλε στο διαχωρισμό της ομάδας ελέγχου από την ομάδα χορήγησης της εσπεριδίνης. Επιπλέον, δυο μεταβολομικές μελέτες πραγματοποιήθηκαν (μια για την αργινίνη και μια για την εσπεριδίνη) σε δείγματα ιστών. Μελετήθηκαν οι μεταβολομικές αλλαγές της απόκρισης που συμβαίνουν στους ιστούς, λόγω της χορήγησης της ναργινίνης και εσπεριδίνης μέσω της τροφής. Έξι μεταβλητές εντοπίστηκαν να διαχωρίζουν την ομάδα ελέγχου από την ομάδα χορήγησης της ναργινίνης και δώδεκα μεταβλητές να διαχωρίζουν την ομάδα ελέγχου από την ομάδα χορήγησης της εσπεριδίνης.