Μελέτη του ρόλου ενός πολυδύναμου μεταγραφικού ρυθμιστή στην ανάπτυξη της Drosophila melanogaster

Abstract

In the present study, we studied the gene CG12701 (FlyBase) synonym to vielfältig) and zld (zelda – Zinc-finger early Drosophila activator) of the Drosophila melanogaster, that codes for a transcription factor reported as Zelda. The transcription factor Zelda is involved in the activation of the Drosophila zygotic genome. During embryogenesis, is shown to binds to a heptamer sequence motif (TAGteam site) found within regulatory regions of genes that play pivotal roles during embryonic development. The transcription of the gene zelda was detected in all four developmental stages of Drosophila by RT-PCR experiments. Those experiments showed continuous expression of the RB (7318 bp) and RD (7632 bp) transcripts, while the RA (6610 bp) transcript was detected only during the pupal stage and the RC (5876 bp) during the stages of the Drosophila embryo, larva and adult. In embryonic wing discs of L3 larvae the transcripts RB, RC and RD were amplified. Moreover, using specific antibody raised against Zelda, Western Blotting experiments showed production of the protein throughout development while immunohistochemical experiments revealed the pattern of production of Zelda in embryonic and larval tissues. In protein extracts from larval wing discs and the remaining larval tissues, the full length Zelda protein was detected (~180kD) together with an isoform of ~70 kD. Overexpressing or knocking down Zelda in the developing wing tissue, showed a certain role of the gene in patterning processes. The phenotypes of several of these experiments indicated its action within the Notch signaling pathway. ChIP experiments, using anti-Zelda Ab followed by PCR amplification of the precipitated fragments with specific primers for regulatory regions of selected genes were performed in wing discs from L3 larvae. The results revealed binding of Zelda to the omb region ~1000 bp upstream the 5’UTR pf bi-RD, bi-RC and bi-RE transcripts. The results of this study show a certain role of the gene in wing development and consider it as possible candidate to be involved in the Notch cascade. However, the results that showed binding of Zelda on an intronic region of omb cannot exclude the fact of its involvement in more than one signaling pathways. The hypothesis that considers Zelda playing a role in the larval stage with a similar mechanism to the one the factor plays during embryogenesis, as an ubiquitous activator of genes that have crucial roles in body patterning, is still valid considering the results of this study.

Στα πλαίσια της παρούσας διατριβής, μελετήθηκε το γονίδιο CG12701 (FlyBase), συνώνυμο των vfl (vielfältig) και zld (zelda – Zinc-finger early Drosophila activator) της Drosophila melanogaster που κωδικοποιεί έναν μεταγραφικό παράγοντα που αναφέρεται ως Zelda. Ο μεταγραφικός παράγοντας Zelda, εμφανίζει κύρια δράση στην ενεργοποίηση του ζυγωτικού γονιδιώματος της Drosophila. Κατά την εμβρυογένεση, έχει δειχθεί ότι μπορεί να προσδένεται σε ένα επταμερές μοτίβο αλληλουχιών (TAGteam sites) το οποίο εντοπίζεται σε ρυθμιστικές περιοχές γονιδίων με κεντρικό ρόλο στην ανάπτυξη του εμβρύου. Η έκφραση του γονιδίου ανιχνεύθηκε με RT-PCR και στα τέσσερα αναπτυξιακά στάδια της Drosophila. Τα πειράματα αυτά, έδειξαν συνεχή έκφραση των μεταγράφων RB (7318 bp) και RD (7632 bp), ενώ το μετάγραφο RA (6610 bp) ανιχνεύεται μόνο στο στάδιο της νύμφης και το RC (5876 bp) στα στάδια του εμβρύου, της προνύμφης και του ενηλίκου. Σε εμβρυϊκούς δίσκους φτερού προνύμφης τρίτου σταδίου, έγινε ανίχνευση των μεταγράφων RB, RC και RD. Επιπλέον, με τη χρήση ειδικού αντισώματος έναντι της Zelda προσδιορίστηκε με ανάλυση κατά Western η παραγωγή της πρωτεΐνης σε όλα τα στάδια ανάπτυξης και με πειράματα ανοσοϊστοχημείας εντοπίστηκε το πρότυπό της σε ιστούς εμβρύου και προνύμφης. Σε πρωτεϊνικά εκχυλίσματα που προήλθαν από δίσκους φτερών προνύμφης 3ου σταδίου καθώς και τους εναπομείναντες ιστούς της προνύμφης, ανιχνεύθηκε η πλήρους μήκους πρωτεΐνη της ZLD (~180kD) καθώς και μία επιπλέον ισομορφή της, η οποία αντιστοιχεί στα ~70 kD. Η υπερέκφραση ή η καταστολή της έκφρασης του γονιδίου zelda στον αναπτυσσόμενο ιστό του φτερού της Drosophila, υπέδειξαν ένα σαφή ρόλο στη διαδικασία καθορισμού του αναπτυξιακού προτύπου, ενώ οι φαινότυποι των αντιστοίχων πειραμάτων συνέτειναν στη δράση του στο σηματοδοτικό μονοπάτι Notch. Για τη μελέτη της in vivo δράσης του γονιδίου δημιουργήθηκαν διαγονιδιακά στελέχη Drosophila με ένθεση της κατασκευής UAS/Zelda στο 3o χρωμόσωμα. Για την εύρεση πιθανών θέσεων πρόσδεσης του μεταγραφικού παράγοντα στο γενετικό υλικό στο στάδιο της προνύμφης, έγιναν πειράματα ανοσοκατακρήμνισης της χρωματίνης (ChIP) σε εμβρυϊκούς δίσκους φτερού προνύμφης 3ου σταδίου. Χρησιμοποιήθηκε αντίσωμα έναντι της Zelda και στα θραύσματα γενετικού υλικού που κατακρημνίστηκαν έγινε PCR με εκκινητές για ρυθμιστικές περιοχές επιλεγμένων γονιδίων. Από τα πειράματα της ChIP ανιχνεύθηκε πρόσδεση της Zelda στην επιλεγμένη περιοχή του γονιδίου omb, ~1000bp αναρροϊκά της 5΄ UTR των μεταγράφων bi-RD, bi-RC και bi-RE. Τα αποτελέσματα της διατριβής δείχνουν ένα σαφή ρόλο του υπό μελέτη γονιδίου στις διαδικασίες ανάπτυξης του φτερού και υποδεικνύουν τη συμμετοχή του στο σηματοδοτικό μονοπάτι Notch. Ωστόσο, η εύρεση της πρόσδεσης του μεταγραφικού παράγοντα σε περιοχή εσωνίου του γονιδίου omb, δεν μπορεί να αποκλείσει την ταυτόχρονη συμμετοχή του σε περισσότερα του ενός σηματοδοτικά μονοπάτια. Η υπόθεση για τον τρόπο δράσης της Zelda στο στάδιο της προνύμφης με μηχανισμό παρόμοιο με εκείνο που χρησιμοποιεί στην εμβρυογένεση, δηλαδή ως καθολικός ενεργοποιητής γονιδίων με κεντρικό ρόλο στην ανάπτυξη δομών του σώματος, παραμένει σε ισχύ σύμφωνα και με τα δεδομένα αυτής της μελέτης.