Μηχανισμοί νευροεκφυλισμού και γήρανσης στο νηματώδη Caenorhabditis elegans: ο ρόλος της ενδοκύττωσης μέσω κλαθρίνης και της ενδοκυτταρικής μεταφοράς κυστιδίων

Abstract

Necrosis is referred to cell death under extreme stress and is involved in many pathological conditions such as stroke and ischemia and in neurodegenerative diseases. In the nematode Caenorabditis elegans death of neurons expressing hyperactive ion channels (degenerins) exhibit morphological and ultrastructural characteristics reminiscent of necrotic cell death caused by excitotoxicity after ischemia in mammals. Electron microscopy studies of necrotic neurons in C. elegans have shown that the first detectable abnormality is an infolding of the plasma membrane and the production of small electron dense whorls (Hall et al., 1997). These whorls are internalized and form large membranous structures indicating that the mechanisms of endocytosis and trafficking may be involved in degeneration. Interestingly disrupted trafficking has been implicated in human neurodegenerative diseases (Nixon et al., 2000, Davies et al., 1997, De Vos et al., 2007, Kieran et al., 2005). In this thesis we utilized C. elegans to investigate the involvement of endocytosis and intracellular trafficking in neurodegeneration. We show that clathrin-mediated endocytosis is essential for necrosis since its obstruction ameliorates cell death independently of the insult. We also found that it synergizes with calpain and cathepsin proteases whereas it acts in parallel with autophagy and V-ATPase. By expressing appropriate fluorescent markers in degenerating neurons in vivo it became apparent that both early and recycling endosomes increase in number during the early stages whereas they are decreased at later stages exactly as clathrin coated pits or vesicles. In parallel we found that kinesins UNC-104 and UNC-116 that transfer various cargoes are required for necrosis as their dysfunction suppresses neurodegeneration independently of the insult. These kinesins act in the same pathway with calpains and in parallel with autophagy and the V-ATPase. In addition, kinesin UNC-104 synergizes with the lysosomal proteases cathepsins whereas kinesin 1 acts in parallel. Based on our findings we propose that clathrin mediated endocytosis and trafficking by kinesins are two processes that are destabilized during necrosis and contribute to the destruction of the cell. Thus, interfering with these cellular functions may protect neurons against neurodegeneration in humans.

Η νέκρωση αναφέρεται στο θάνατο από το έντονο στρες και εμπλέκεται σε πολλές παθολογικές καταστάσεις όπως τα εγκεφαλικά επεισόδια και η ισχαιμία καθώς και σε νευροεκφυλιστικές ασθένειες. Στο νηματώδη Caenorabditis elegans, ο θάνατος των νευρώνων που εκφράζουν υπέρ-ενεργά ιοντικά κανάλια (degenerins) παρουσιάζει παρόμοια μορφολογικά και υποκυτταρικά χαρακτηριστικά με τον νεκρωτικό θάνατο νευρώνων θηλαστικών μετά από υπερδιέγερση τους κατά την ισχαιμία. Μελέτες ηλεκτρονικής μικροσκοπίας σε νεκρωτικούς νευρώνες C. elegans έδειξαν ότι η πρώτη εμφανής ανωμαλία είναι η αναδίπλωση της πλασματικής μεμβράνης και η παρουσία μικρών περιελίξεων (Hall et al., 1997). Οι περιελίξεις εσωτερικεύονται και σχηματίζουν μεγάλες μεμβρανικές δομές υποδεικνύοντας ότι μπορεί να εμπλέκονται οι μηχανισμοί της ενδοκύττωσης και μεταφοράς κυστιδίων. Είναι ενδιαφέρον ότι διακοπτόμενη ενδοκυτταρική μεταφορά έχει συσχετιστεί και με ανθρώπινες νευροεκφυλιστικές ασθένειες (Nixon et al., 2000 Davies et al., 1997 De Vos et al., 2007, Kieran et al., 2005). Στη διατριβή αυτή χρησιμοποιήσαμε το Caenorabditis elegans για να εξετάσουμε την συμβολή της ενδοκύττωσης μέσω κλαθρίνης και της ενδοκυτταρικής μετακίνησης κυστιδίων στο νευροεκφυλισμό. Βρέθηκε ότι η ενδοκύττωση απαιτείται για τη νέκρωση καθώς η παρεμπόδιση της καταστέλλει τον θάνατο ανεξαρτήτως αιτίου. Επιπλέον αποκαλύφθηκε ότι συνεργάζεται με τις πρωτεάσες καλπαΐνες και καθεψίνες ενώ δρα παράλληλα με την αυτοφαγία και τη V-ATPase. Εκφράζοντας κατάλληλους φθορίζοντες δείκτες σε ζωντανούς εκφυλιζόμενους νευρώνες φάνηκε ότι ο αριθμός των πρωίμων και ανακυκλώσιμων ενδοσωμάτων αυξάνεται αρχικά ενώ στη συνέχεια μειώνεται όπως και ο αριθμός των καλυμμένων με κλαθρίνη βοθρίων ή κυστιδίων. Παράλληλα βρέθηκε ότι οι κινεσίνες UNC-104 και UNC-116 που μεταφέρουν διαφόρων ειδών φορτία απαιτούνται για τη νέκρωση καθώς η δυσλειτουργία τους περιορίζει το νευροεκφυλισμό ανεξαρτήτως αιτίου. Οι κινεσίνες δρουν στο ίδιο μονοπάτι με τις καλπαΐνες και παράλληλα με την αυτοφαγία και την αντλία πρωτονίων V-ATPase. Επιπλέον, η κινεσίνη UNC-104 συνεργάζεται με τις λυσοσωμικές καθεψίνες ενώ η κινεσίνη 1 δρα παράλληλα. Με βάση τα ευρήματα της παρούσας διατριβής προτείνεται ότι η ενδοκύττωση και η μεταφορά κυστιδίων αποσταθεροποιούνται κατά τη νέκρωση και συνεισφέρουν στην καταστροφή του κυττάρου. Η παρέμβαση επομένως στις κυτταρικές αυτές λειτουργίες θα μπορούσε να προστατεύσει ακόμα και τους ανθρώπινους νευρώνες από τον νευροεκφυλισμό.