Μελέτη των συνθηκών απομόνωσης και προσδιορισμού συγκεντρώσεων αντικαταθλιπτικών και αντιψυχωσικών φαρμάκων σε βιολογικά δείγματα

Abstract

Sample preparation is of great significance for a successful toxicological analysis. The development of simple, effective and rapid extraction procedures of drugs from clinical or post-mortem biological samples is challenging. In the current thesis the development of efficient methods for the isolation and determination of drugs in such specimens was studied. First a Headspace-Solid Phase Microextraction (HS-SPME) procedure for the determination of venlafaxine in post-mortem biological samples by gas chromatography (GC) was developed. Venlafaxine was extracted on a 100 μm Polydimethylsiloxone (PDMS) coating SPME fiber and was determined by GC with nitrogen-phosphorous detector (NPD). HS-SPME offers significant advantages such as simplicity, low cost, compatibility with analytical systems, automation and solvent-free extraction. Salt addition, extraction temperature, preheating and extraction time were optimized to achieve high extraction recovery for venlafaxine. The developed method was simple and rapid, using HS-SPME for sample preparation prior to GC-NPD determination. Validation data was satisfactory, thus enabling application in the toxicological analysis of forensic samples. The developed protocol was applied to post-mortem biological samples of a fatally poisoned woman from venlafaxine. The drug was quantified in post-mortem blood, gastric and oesophagus contents of the deceased woman. Thereafter, the development of a LC-MS/MS method able to detect and quantify 15, most commonly prescribed antipsychotic and antidepressant drugs in blood was performed based on a quick and efficient method. QuEChERs (quick, easy, cheap, effective, rugged and safe) methodology was applied and an optimum protocol was selected after applying different conditions. The selected single-step QuEChERs protocol includes addition of acetonitrile, potassium carbonate and magnesium sulfate in 100 mL sample, stirring, centrifugation and evaporation. The method achieves satisfactory recovery of the 15 drugs of 85%, provides efficient purification of the sample from endogenous interferences, simplicity and short sample handling times. Separation of compounds was performed on a C-18 BEH Aqcuity column by Ultra High-Pressure Chromatography (UHPLC) over 11 min with gradient elution. Detection was performed by the SRM (selective reaction monitoring) technique. The method was validated and provided accurate (+ - 8%) and reproducible (6%) results in a short period of time, a critical parameter for the implementation of a trustworthy and accurate toxicological analysis. Such an approach can be useful in clinical and forensic toxicology for drug analysis in blood as drug of abuse and pharmaceuticals are chemically diverse and may benefit from multi-analyte and multi-class analysis.

Στην παρούσα διατριβή πραγματοποιήθηκε η ανάπτυξη μεθόδων προσδιορισμού ψυχιατρικών φαρμάκων με σύγχρονες τεχνολογίες ανάλυσης και προκατεργασίας δείγματος. Αρχικά το ενδιαφέρον εστιάστηκε στο προσδιορισμό βενλαφαξίνης. Επιλέχθηκε η τεχνική της Μικροεκχύλιση Στερεάς Φάσης (Solid Phase Microextraction-SPME) σε συνδυασμό με την Αέρια Χρωματογραφία με ανιχνευτή αζώτου Φωσφόρου (Gas Chromatography with Nitrogen-Phosphorus Detector).Αρχικά έγινε βελτιστοποίηση των παραμέτρων ανάλυσης: συνθήκες ανάλυσης στο GC/NPD, επιλογή της κατάλληλης ίνας, του pΗ του διαλύματος, της προσθήκη άλατος, της θερμοκρασίας του θερμοστατικού λουτρού, ο χρόνος προθέρμανσης και ο χρόνος εκχύλισης. Τα αποτελέσματα καταδεικνύουν ότι η παραπάνω μέθοδος μπορεί σε ικανοποιητικό βαθμό να χρησιμοποιηθεί στην ανίχνευση και στον ποσοτικό προσδιορισμό της βενλαφαξίνης σε βιολογικά δείγματα θανατηφόρων περιστατικών (π.χ. αυτοκτονίες). Στην συνέχεια έμφαση δόθηκε στην ανάπτυξη και βελτιστοποίηση μεθόδου για τον προσδιορισμό 15 ευρέως συνταγογραφούμενων αντιψυχωτικών και αντικαταθλιπτικών φαρμάκων με υγρή χρωματογραφία σε συνδυασμό με φασματομετρία μαζών σε σειρά (LC-MS/ΜS) με στόχο την εφαρμογή της σε βιολογικά δείγματα κλινικών αλλά και νεκροτομικών περιστατικών. Μελετήθηκε η βελτιστοποίηση της ανάκτησης των φαρμάκων από ορό αίματος και μεταθανάτιο ολικό αίμα. Για την προκατεργασία εφαρμόστηκε η τεχνική QuEChERS και τα αποτελέσματα συγκρίθηκαν με την απλή μέθοδο πρωτεινικής καταβύθισης. Δοκιμάσθηκαν διαφορετικά πρωτόκολλα QuEChERS, δύο σταδίων αλλά και προσαρμοσμένα ενός σταδίου και παρουσιάζονται για πρώτη φορά αποτελέσματα απομόνωσης αυτών των φαρμάκων με προσαρμοσμένο πρωτόκολλο QuEChERS ενός βήματος. Ο διαχωρισμός των ενώσεων πραγματοποιήθηκε σε στήλη τύπου C-18 με χρωματογραφία υπερυψηλής πίεσης μέσα σε 11 min με βαθμωτή έκλουση ενώ η ανίχνευση και ποσοτικοποίηση γίνεται με την τεχνική SRM (selective reaction monitoring) σε φασματογράφο. Το βέλτιστο πρωτόκολλο προσαρμοσμένης QuEChERS ενός βήματος που περιλαμβάνει προσθήκη ακετονιτριλίου, ανθρακικού καλίου και θειικού μαγνησίου σε 100 μL δείγματος, ανάδευση, φυγοκέντριση και εξάτμιση, επιτυγχάνει ικανοποιητική ανάκτηση των 15 φαρμάκων της τάξεως του 85% και ταυτόχρονα τον ικανοποιητικό καθαρισμό του δείγματος από ενδογενείς παρεμποδίσεις, ενώ παρέχει απλότητα και σύντομους χρόνους χειρισμού του δείγματος. Επιπλέον πλεονεκτεί στους μικρούς όγκους απαιτούμενου δείγματος. Η μέθοδος ποσοτικού προσδιορισμού επικυρώθηκε και παρείχε ακριβή (+/- 8% ) και επαναλήψιμα (6% ) αποτελέσματα σε σύντομο χρονικό διάστημα, παράμετρο πολύ κρίσιμη για την εφαρμογή της σε περιστατικά που χρήζουν τοξικολογικής εξέτασης. Επιπλέον καλύπτει μεγάλο εύρος συγκεντρώσεων με δυνατότητα εφαρμογής της τόσο για την ανίχνευση υποθεραπευτικών χαμηλών συγκεντρώσεων, όσο και για τον έλεγχο τοξικών επιπέδων. Εφαρμόστηκε με επιτυχία για τον προσδιορισμό σε 13 περιστατικά για τον έλεγχο των επιπέδων των φαρμάκων σε ορό αίματος ασθενών υπό θεραπευτικό σχήμα καθώς και σε 9 περιστατικά μεταθανάτιων δειγμάτων αίματος και μπορεί να αποτελέσει αξιόπιστο και σημαντικό εργαλείο στην τοξικολογική ανάλυση.