Μελέτη της λειτουργίας και του επανασυγχρονισμού του ημερήσιου βιολογικού ρολογιού στο φασόλι (Phaseolus vulgaris)

Abstract

Plants, as sessile organisms, have developed complex mechanisms to cope with the various environmental changes. One of these is the circadian clock, which generates the 24-hour rhythms in the physiology and behavior of the organisms, in agreement with the geophysical time. It coordinates important plant functions such as photosynthesis, metabolism and flowering. Therefore, plants with well-synchronized circadian clocks exhibit increased fitness, resistance and hence, higher yields. The plant clock is composed of three structural components: the signaling input pathways, the endogenous central oscillator and its output pathways, i.e. the biochemical and physiological rhythms under the control of the clock. The main signaling cue of the clock is light, which synchronizes the central oscillator through the photoreceptors. The central oscillator consists of feedback loops of transcription factors with, mainly, repressive function.Phaseolus vulgaris (common bean) was selected as the experimental plant, to study the function of the circadian clock. Besides its high nutritional value and hence its cultivation interest, there is evidence that the bean clock operates in a different way from that of the widely-studied Arabidopsis thaliana, a fact that was reinforced by the present work. These variations may reflect different mechanisms of adaptation to the environment. Thus, it has been challenging to analyze aspects of the clock function in bean in order to study the molecular mechanism that governs it. Its in vitro culture, however, presents significant problems, which makes the production of transgenic bean plants particularly difficult. Thus, to study the molecular mechanisms of the bean circadian clock, an in vitro cellular system of bean leaf protoplasts, which possesses a functional circadian clock, was developed and, therefore, it was largely used in the experiments of the present study.In the first part of the thesis experiments regarding the study of the expression patterns of putative clock genes are being presented. As a next step, the clock resynchronization was investigated. In bean, resynchronization by light was studied in respect to PvLHY, a morning expressed clock gene. Thus, additionally, resynchronization by light regarding the rhythms of the evening expressed genes, PvTOC1 and PvELF4, was explored. A response of evening expressed genes to light at night, which is governed by the clock, was revealed for the first time. Moreover, the observed oscillations in gene expression were correlated to a physiological plant response, the periodic 24-hour leaf movements, a fact that reinforced the observation that the bean clock is receptive to light at night.To study the bean circadian clock’s central oscillator, the promoters of three of its key factors, PvTOC1, PvELF4 and PvLHY were isolated and the function of selected cis-regulatory elements was examined. Furthermore, an in vivo method for recording the rhythmic activity of a reporter driven by clock gene promoters in the same sample of living bean protoplasts was developed. Finally, focus was given on the role of the central clock element, PvTOC1, which was found to exhibit self-reppression activity, by reducing the promoter activity of its own gene, in addition to repressing its expected target, PvLHY. The PvTOC1 promoter region, where this repression takes place, as well as the functional domain of the PvTOC1 protein that is necessary for this action were identified. Therefore, a role to the PvTOC1 protein was assigned, which has not been reported before for orthologue proteins in any plant species.Briefly, in this study, the bean circadian clock was examined, both in terms of its synchronization by light and the function of central elements of its molecular mechanism. For this purpose, an in vitro bean protoplast system was developed, thereby creating a new tool that can be used in bean research. The experiments and conclusions of the present work open new paths to study the mechanisms and function of the bean circadian clock and provide the basis for the expansion of the research in this field, leading to a deeper understanding of the circadian clock and to the perspective to develop new, improved bean varieties with higher crop yields and/or resistant to environmental stress.

Τα φυτά, ως οργανισμοί που δεν έχουν τη δυνατότητα μετακίνησης, έχουν αναπτύξει πολύπλοκους μηχανισμούς για να αντιδρούν στις διάφορες περιβαλλοντικές αλλαγές. Ένας από αυτούς είναι το ημερήσιο βιολογικό ρολόι (ΗΒΡ), το οποίο παράγει 24-ωρους ρυθμούς στη φυσιολογία και τη συμπεριφορά των οργανισμών, σε συμφωνία με το γεωφυσικό χρόνο. Το ΗΒΡ συντονίζει σημαντικές λειτουργίες των φυτών, όπως η φωτοσύνθεση, ο μεταβολισμός και η άνθηση. Ως εκ τούτου, φυτά με καλά συγχρονισμένο ΗΒΡ παρουσιάζουν αυξημένη ευρωστία, ανθεκτικότητα και, κατ’ επέκταση, βελτιωμένες αποδόσεις. Το ΗΒΡ συγκροτείται από τρία δομικά συστατικά: τα μονοπάτια σηματοδότησης του κεντρικού ταλαντωτή (μονοπάτια εισόδου), τον ενδογενή κεντρικό ταλαντωτή και τα μονοπάτια εξόδου από αυτόν, δηλαδή τους βιοχημικούς και φυσιολογικούς ρυθμούς υπό τον έλεγχο του ρολογιού. Ο κύριος παράγοντας σηματοδότησης του ΗΒΡ είναι το φως, το οποίο συγχρονίζει το κεντρικό ταλαντωτή, μέσω των φωτοδεκτών. Ο κεντρικός ταλαντωτής αποτελείται από βρόχους επανατροφοδότησης μεταγραφικών παραγόντων με, κυρίως, αρνητική δράση.Για τη μελέτη της λειτουργίας του ΗΒΡ επιλέχτηκε ως πειραματόφυτο το φασόλι (Phaseolus vulgaris). Στο φασόλι, πέραν της υψηλής διατροφικής του σημασίας και του καλλιεργητικού του ενδιαφέροντος, υπήρχαν στοιχεία ότι το ΗΒΡ λειτουργεί με διαφορετικό τρόπο από αυτό του ευρέως μελετώμενου Arabidopsis thaliana, γεγονός που ενισχύθηκε και από την παρούσα εργασία. Καθώς οι διαφορές αυτές πιθανά να αντικατοπτρίζουν διαφορετικούς μηχανισμούς προσαρμογής στο περιβάλλον, έχει σημασία η μελέτη της λειτουργίας του ΗΒΡ στο φασόλι και του μοριακού μηχανισμού που το διέπει. Η in vitro καλλιέργειά του, όμως, παρουσιάζει σημαντικά προβλήματα, καθιστώντας τη δημιουργία διαγονιδιακών φυτών φασολιού ιδιαίτερα δύσκολη. Έτσι, αναπτύχθηκε ένα in vitro κυτταρικό σύστημα πρωτοπλαστών από φύλλα φασολιού, το οποίο αφού διαπιστώθηκε ότι διαθέτει άριστα λειτουργικό ΗΒΡ, χρησιμοποιήθηκε για μεγάλο μέρος των πειραμάτων της παρούσας εργασίας.Στο πρώτο μέρος της διατριβής παρουσιάζονται πειράματα με στόχο τη μελέτη των ρυθμών της έκφρασης υποψηφίων γονιδίων του ρολογιού. Στη συνέχεια, μελετήθηκε ο επανασυγχρονισμός του ρολογιού. Στο φασόλι, ο επανασυγχρονισμός από το φως είχε μελετηθεί ως προς την απόκριση του PvLHY, ενός πρωινά εκφραζόμενου γονιδίου του ρολογιού. Έτσι, εξετάσθηκε επιπροσθέτως ο επανασυγχρονισμός από το φως των ρυθμών των εσπερινών γονιδίων, PvTOC1 και PvELF4 και δείχτηκε για πρώτη φορά απόκριση εσπερινών γονιδίων στο φως τη νύχτα, η οποία ρυθμίζεται από το ρολόι. Αυτές οι παρατηρήσεις συνδέθηκαν στη συνέχεια με μία φυσιολογική λειτουργία του φυτού, την περιοδική 24-ωρη κίνηση των φύλλων του, ενισχύοντας, έτσι, την άποψη ότι το ρολόι του φασολιού είναι δεκτικό στο φως τη νύχτα.Για τη μελέτη του κεντρικού ταλαντωτή του ΗΒΡ του φασολιού, απομονώθηκε μέρος των υποκινητών τριών εκ των βασικών παραγόντων του, PvTOC1, PvELF4 και PvLHY και μελετήθηκε η λειτουργία cis-ρυθμιστικών στοιχείων τους. Επιπρόσθετα, αναπτύχθηκε μία μέθοδος in vivo καταγραφής της ρυθμικής ενεργότητας υποκινητών γονιδίων του ρολογιού με τη χρήση γονιδίου αναφοράς, από το ίδιο δείγμα ζωντανών πρωτοπλαστών, σε διαφορετικές χρονικές στιγμές. Τέλος, έμφαση δόθηκε στο ρόλο του παράγοντα PvTOC1, κεντρικού στοιχείου του ρολογιού ο οποίος εκτός από την καταστολή του αναμενόμενου στόχου του, PvLHY, παρουσίασε και αυτοκαταστολή, μειώνοντας την ενεργότητα του υποκινητή του ίδιου του γονιδίου του. Επιπλέον, εντοπίστηκε η περιοχή του υποκινητή του PvTOC1 η οποία εμπλέκεται στην καταστολή της μεταγραφικής έκφρασης, καθώς και η λειτουργική περιοχή της πρωτεΐνης PvTOC1 η οποία είναι απαραίτητη για αυτή τη δράση. Προσδόθηκε, έτσι, ένας ρόλος στην πρωτεΐνη PvTOC1, ο οποίος δεν είχε αναφερθεί για ορθόλογές της από άλλα φυτικά είδη.Συνοπτικά, στην παρούσα εργασία μελετήθηκε το ΗΒΡ του φασολιού, τόσο ως προς τον επανασυγχρονισμό του (π.χ. φως), όσο και ως προς τη λειτουργία κεντρικών στοιχείων του μοριακού μηχανισμού του. Για την διενέργεια των πειραμάτων, αναπτύχθηκε ένα in vitro σύστημα πρωτοπλαστών φασολιού για την μελέτη του ΗΒΡ του φυτού, δημιουργώντας με αυτόν τον τρόπο ένα νέο εργαλείο που μπορεί να χρησιμοποιηθεί γενικότερα για την έρευνα στο φασόλι. Τα πειράματα και τα συμπεράσματα της εργασίας αυτής ανοίγουν καινούριους δρόμους στη μελέτη των μηχανισμών και της λειτουργίας του ΗΒΡ στο φασόλι και παρέχουν τις βάσεις για την περαιτέρω διεύρυνση της έρευνας στο πεδίο, η οποία μπορεί να καταλήξει στην κατανόηση του ΗΒΡ και ως εκ τούτου στην ανάπτυξη νέων, βελτιωμένων ποικιλιών φασολιού, με αυξημένες αποδόσεις και/ή ανθεκτικότητα σε καταπονήσεις του περιβάλλοντος.