Ηλεκτροφυσιολογική και βιοχημική μελέτη υποδοχέων σχετιζομένων με ασθένειες του κεντρικού νευρικού συστήματος

Abstract

Neuronal nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) are located mainly in the Central Nervous System (CNS) where they regulate the release of neurotransmitters and mediate fast neurotransmission. Neurotransmitters transfer the information from a neuron to an adjacent neuron or muscle cell. Some examples of neurotransmitters are acetylcholine (ACh), serotonin, γ-aminobutyric acid (GABA) and glycine. nAChRs belong to the ‘Cys-loop’ super-family of pentameric ligand-gated ion channels (pLGIC), since this type of receptors possess a characteristic loop formed by 13 highly conserved amino acids between two cysteine (Cys) residues bridged by a disulfide bond, at the N-terminal extracellular domain (ECD). Moreover the Cys-loop superfamily includes the γ-aminobutyric acid (GABAA and GABAC), glycine and serotonin (5-HT3) receptors. They consist of the combination of 9 α (α2-α10) and 3 β (β2-β4) subunits and they are distributed ubiquitously in the brain. The neuronal nAChRs exist either as homopentameric or as heteropentameric molecules. The α7 and α9 subunits are the only known human nAChR subunits that can form homopentamers. They are implicated in various neurological diseases, such as Alzheimer and Parkinson diseases, epilepsy, attention deficit hyperactivity disorder, depression, neuropathic pain and substance addiction. Thus, drug development for these receptors is a priority. These neurotransmitters bind to the ECD of the corresponding receptors, thus, it is very important to know the 3D structure of this region. In general, the ECD of neuronal nAChRs, consists of an N-terminal α-helix and a hydrophobic core of 10 β-strands (β1-β10). Some of the characteristic loops, linking these β-strands, contribute to the formation of the ligand- binding site. Loops A, B, and C contribute to the formation of the primary (+) binding site, whereas the loops D, E and F conferred from the adjacent subunit form the complementary (-) side of the ligand binding site.The principal binding sides of the neuronal nAChRs are very homologous among the various subunits, whereas there is little conservation in the complementary sides, which are those that confer selectivity to various drugs. Thus, in order to design highly specific and effective drugs towards a specific nAChR subtype and avoid side-effects, its in-depth structural and functional information is highly needed. Towards this aim, members of our laboratory have recently acquired important structural crystallographic data for the ECDs of two subunits of human nAChRs: the α9 and α2. In the nature, the α9 subunit forms either homopentamers or heteropentamers with α10, whereas α2 is known to form heteropentamers with the β2 subunit. It is worth mentioning that α2 presents high homology with the α4 subunit (78%), which is the most commonly found nAChR subunit in the human brain. In the above studies, the crystal structures of the ECDs of the human α9 and α2 subunits were presented. The structure of α9-ECD was determined as a monomer in its free-state and in its complexes with the antagonists methylcaconitine (MLA) and α-Bungarotoxin (α-Bgtx), whereas α2-ECD was crystallized as a homopentamer in complex with the agonist Epibatidine (Epi). In the present thesis, some characteristic structural elements and interactions, revealed from these structural studies on the α9 and α2 ECDs were evaluated regarding their functional impact by electrophysiological studies. More specifically, the structure of α9-ECD revealed a novel β7-β10 strand interaction between Thr203 (invariant in nAChR α subunits) and Thr147 (unique in α9 and in α10). Subsequent electrophysiological studies performed in this thesis, showed that this unique β7-β10 strand interaction in α9 nAChRs is critical for coupling agonist binding to gating. Moreover, based on the X-ray crystal structure of α2-ECD, we provided electrophysiological data on structural elements which are involved in ligand binding and/or the activation and desensitization of α2β2 nAChRs.It is worth mentioning that α2β2 nAChR has two subtypes or stoichiometries: the (α2)3(β2)2, which is the low-sensitivity (to agonists) subtype (LS) and the (α2)2(β2)3, which is the high-sensitivity (HS) subtype. We evaluated the functional role of an invariable α2 residue, Trp84, which is located on loop D of the complementary side of α2, and showed that this residue is involved in the ACh-binding ability, potency and desensitization rate of the LS-subtype of α2β2 nAChR. More importantly, through mutational and subsequent electrophysiological studies on the α2 subunit, we provided solid evidence for the presence of the α2(+)/α2(−) binding site on the α2β2 LS subtype. Also, in the α2-Epi structure, loop F found at a very close proximity to loop C, as the side-chain of Tyr199 (Loop C) forms a hydrogen bond with the backbone carbonyl Cys221 (loop F). Thus, we investigated the functional role of Tyr199 on the minus side of α2 and the corresponding residue Phe169 on the minus side β2 subunit through single-point mutations and subsequent electrophysiological analysis. We showed that loop F has a distinct role on these two subunits since mutation of a particular amino acid residue of the loop seemed to have significant effects on the EC50 values of ACh on both LS and HS subtypes of α2β2 nAChR.In conclusion, following structure-guided mutagenesis, the electrophysiological data presented in the current thesis, confirmed the presence of the α2(+)/α2(-) binding site on the LS α2β2 subtype and validated the functional significance of specific amino acid residues in the α2 and β2 nAChR subunits. Given the pathological importance of the α2 subunit and the high sequence identity with α4 (78%) and with other neuronal nAChR subunits, our findings offer valuable information for modeling several nAChRs and ultimately for structure based design of subtype specific drugs against the nAChR- associated diseases.In addition, in collaboration with Dr Matsa’s and Dr Thomaidou Labs we have obtained electrophysiological data in two projects involving induced pluripotent stem cell–derived neurons for the research of Parkinson disease (PD) and reprogramming astrocytes to neurons. Parkinson disease (PD) is an incurable neurodegenerative disorder, characterized by motor and non-motor deficits, including cognitive decline and dementia. The protein α-Synuclein is strongly associated with PD pathogenesis, whereas α-Synuclein mutations, such as p.A53T, cause familial forms of PD. The question to be addressed by electrophysiology was whether the induced neurons had reached such a maturation degree so as to present the electrical properties of neurons. Indeed our electrophysiological data showed that these cells exhibited electrical properties of neurons. Lastly, our electrophysiological data demonstrated that overexpression of Cend1, in conjunction with neurogenin-2 at high levels leads the nerve stem/progenitor cells to exit the cell cycle and differentiate specifically to the neuronal phenotype. Specifically, the electrophysiological study showed that these cells had electrical properties of neurons.

Οι νευρωνικοί νικοτινικοί υποδοχείς της ακετυλοχολίνης (nAChRs) εντοπίζονται κυρίως στο κεντρικό νευρικό σύστημα (ΚΝΣ) και εμπλέκονται στην ταχεία μεταβίβαση της νευρικής ώσης καθώς και στη ρύθμιση της έκκρισης νευροδιαβιβαστών για τη μεταβίβαση πληροφοριών από έναν σε άλλον ή σε μυϊκό κύτταρο. Μερικά παραδείγματα νευροδιαβιβαστών είναι η ακετυλοχολίνη (ACh), η σεροτονίνη, το γ-αμινοβουτυρικό οξύ (GABA) και η γλυκίνη (Glycine).Οι νευρωνικοί nAChRs ανήκουν στην υπεροικογένεια πενταμερών ιοντικών καναλιών (pentameric Ligand Gated Ionic Channels - pLGIC) ή Cys-loop υπεροικογένεια, επειδή διαθέτουν μία χαρακτηριστική θηλιά (Cys-loop) 13 υψηλά συντηρημένων αμινοξέων μεταξύ δύο αμινοξικών καταλοίπων κυστεΐνης (Cys) στην εξωκυτταρική τους περιοχή. Στην υπεροικογένεια αυτή περιλαμβάνονται και οι υποδοχείς γ-αμινοβουτυρικού οξέος (GABAA και GABAC), γλυκίνης (GlyR) και σεροτονίνης (5-ΗΤ3). Οι νευρωνικοί nAChRs απαρτίζονται από 9 α (α2-α10) και 3 β (β2-β4) υπομονάδες σε διάφορους συνδυασμούς που κατανέμονται παντού στον εγκέφαλο ως ομοπενταμερή ή ετεροπενταμερή μόρια. Οι α7 και α9 υπομονάδες είναι οι μόνες ανθρώπινες υπομονάδες nAChRs που μπορούν να σχηματίζουν και ομοπενταμερή μόρια.Οι νευρωνικοί nAChRs συμμετέχουν σε διάφορες νευρολογικές παθήσεις, όπως οι νόσοι Alzheimer και Parkinson, η ελλειμματική προσοχή, η υπερκινητικότητα, η κατάθλιψη, ο νευροπαθητικός πόνος, και η εξάρτηση από ουσίες. Έτσι, η ανάπτυξη φαρμάκων για αυτούς τους υποδοχείς αποτελεί προτεραιότητα. Επειδή οι νευροδιαβιβαστές προσδένονται σε ειδικά σημεία πρόσδεσης (ορθοστερικά σημεία πρόσδεσης) στo εξωκυττάριο τμήμα (ECD: extracellular domain) των υποδοχέων αυτών, είναι πολύ σημαντικό να γνωρίζουμε τη δομή της περιοχής αυτής. Γενικά, τα ECD των υπομονάδων των nAChRs αποτελούνται από μία αμινο-τελική α-έλικα και από έναν υδρόφοβο πυρήνα 10 β-πτυχωτών φύλλων (β1-β10). Μεταξύ μερικών από τα πτυχωτά αυτά φύλλα δημιουργούνται χαρακτηριστικές θηλιές που συμμετέχουν στο σχηματισμό της θέσης πρόσδεσης των υποκαταστατών. Οι θηλιές αυτές είναι η Α, Β και C, οι οποίες συνεισφέρουν στο σχηματισμό της κύριας (+) πλευράς πρόσδεσης και οι θηλιές D, E και F που βρίσκονται στη γειτονική υπομονάδα και οι οποίες απαρτίζουν τη συμπληρωματική (-) πλευρά πρόσδεσης των υποκαταστατών. Oι κύριες πλευρές πρόσδεσης παρουσιάζουν μια αρκετά υψηλή ομολογία μεταξύ των νευρωνικών nAChRs, σε αντίθεση με τις συμπληρωματικές, οι οποίες είναι και αυτές που καθορίζουν την επιλεκτικότητα έκαστου nAChR υποτύπου έναντι διαφόρων φαρμάκων. Επομένως, ο σχεδιασμός ειδικών και αποτελεσματικών φαρμάκων για τους διάφορους nAChRs είναι μια δύσκολη διαδικασία και απαιτεί την άντληση περισσότερων δομικών και λειτουργικών πληροφοριών για έκαστο υπότυπο nAChR. Πρόσφατα, από μέλη του εργαστηρίου μας πραγματοποιήθηκαν δομικές μελέτες για τα ECDs δύο ανασυνδυασμένων υπομονάδων ανθρωπίνων nAChRs, της α9 και της α2. Στη φύση η α9 υπομονάδα σχηματίζει είτε ομοπενταμερή υποδοχέα, είτε ετεροπενταμερή μαζί με την α10, ενώ η α2 σχηματίζει ετεροπενταμερή με την β2. Αξίζει να σημειωθεί ότι η α2 παρουσιάζει υψηλή ομολογία με την α4 υπομονάδα (78%), η οποία είναι η επικρατέστερη υπομονάδα nAChR στον ανθρώπινο εγκέφαλο. Στις πρόσφατες δομικές μελέτες του εργαστηρίου παρουσιάστηκαν δομικά στοιχεία για τη (+) πλευρά της θέσης πρόσδεσης της α9 υπομονάδας της οποίας το ECD κρυσταλλώθηκε ως ελεύθερο μονομερές, αλλά και ως σύμπλοκο με τους ανταγωνιστές μεθυλ-κακονιτίνη (MLA) και α-Bungarotoxin (α-Bgtx), καθώς και δομικά στοιχεία για ολόκληρη τη θέση πρόσδεσης υποκαταστατών στην διεπιφάνεια μεταξύ ECDs α2 υπομονάδων από την κρυστάλλωση του α2-ECD ως ομοπενταμερούς μορίου σε σύμπλοκο με τον αγωνιστή επιβατιδίνη (Epi). Στην παρούσα διατριβή αξιολογήθηκαν με ηλεκτροφυσιολογικές μελέτες μερικά χαρακτηριστικά δομικά στοιχεία που ελήφθησαν για τα ECDs των α9 και α2 υπομονάδων, όσον αφορά τη λειτουργική τους σημασία . Πιο συγκεκριμένα, η κρυσταλλική δομή της α9-ECD αποκάλυψε μια αλληλεπίδραση μεταξύ των β7-β10 πτυχωτών φύλλων και συγκεκριμένα μεταξύ της Thr203 (αυστηρά συντηρημένη στις α υπομονάδες των nAChR) και της Thr147 (μοναδική στις α9 και α10 υπομονάδες). Στη διατριβή αυτή, δείχθηκε με μεταλλάξεις και ακολούθως με ηλεκτροφυσιολογική μελέτη, ότι αυτή η μοναδική αλληλεπίδραση στα β7-β10 πτυχωτά φύλλα στους α9α10 nAChRs είναι κρίσιμη για την πρόσδεση αγωνιστών για το άνοιγμα του διαύλου.Επιπλέον, με βάση τη λύση της δομής της α2-ECD, πραγματοποιήθηκαν στοχευμένες μεταλλάξεις, των οποίων ο αντίκτυπος στη λειτουργία ολόκληρων των α2/β2 υποδοχέων μελετήθηκε επίσης με ηλεκτροφυσιολογικές μελέτες. Με τις μελέτες αυτές αντλήθηκαν κυρίως λειτουργικά δεδομένα για τα δομικά στοιχεία τα οποία εμπλέκονται στην πρόσδεση διαφόρων αγωνιστών στους α2β2 nAChRs καθώς και στην ενεργοποίηση και απευαισθητοποίησή τους. Αξίζει να σημειωθεί ότι ο α2β2 nAChR υπάρχει σε δύο στοιχειομετρίες ή υποτύπους: ο (α2)3(β2)2 είναι ο χαμηλής ευαισθησίας (όσον αφορά την απόκριση σε αγωνιστές) υπότυπος (LS: low sensitivity), και ο (α2)2(β2)3 είναι ο υψηλής ευαισθησίας (HS: high sensitivity) υπότυπος. Το πρώτο αμινοξικό κατάλοιπο που μελετήθηκε ήταν η αυστηρά συντηρημένη στις α-υπομονάδες Trp84 της α2-υπομονάδας (βρίσκεται στη συμπληρωματική πλευρά της α2 υπομονάδας). Συγκεκριμένα στην παρούσα μελέτη, δείχθηκε ότι το κατάλοιπο αυτό εμπλέκεται στην πρόσδεση και την δραστικότητα της ACh στον LS υπότυπο του α2β2 nAChR αλλά και στον ρυθμό απευαισθητοποίησής του. Το πιο σημαντικό είναι ότι, μέσω ηλεκτροφυσιολογικών δεδομένων συγκεκριμένων μεταλλάξεων στην α2 υπομονάδα, παραθέτουμε ισχυρή απόδειξη για την παρουσία της θέσης πρόσδεσης α2(+)/α2(-) στον α2β2 LS-υπότυπο. Επίσης, από τη δομή του συμπλόκου της α2 με την επιβατιδίνη (α2-Epi), παρατηρήθηκε ότι η θηλιά F αλληλεπιδρά με τη θηλιά C μεταξύ γειτονικών α2 υπομονάδων, καθώς η πλευρική αλυσίδα της Tyr199 (Θηλιά F, συμπληρωματική πλευρά της α2 υπομονάδας) σχηματίζει έναν δεσμό υδρογόνου με το καρβονύλιο της Cys221 (Θηλιά C, κυρίως πλευρά α2 ). Έτσι, διερευνήσαμε το λειτουργικό ρόλο της Tyr199 στην α2 αλλά και του αντίστοιχου αμινοξέος στη β2 υπομονάδα (Phe169). Δείξαμε με μεταλλάξεις και ηλεκτροφυσιολογικές μελέτες, ότι η θηλιά F κατέχει έναν ξεχωριστό ρόλο σε αυτές τις δύο υπομονάδες αφού μεταλλάξεις στη συγκεκριμένη θέση της τόσο στην α2 όσο και στην β2 υπομονάδα επηρεάζουν τόσο το EC50 στην ACh και στους δύο υπότυπους του α2β2 nAChR (LS και HS).Συμπερασματικά, ακολουθώντας δομο-επαγόμενες μεταλλάξεις, τα ηλεκτροφυσιολογικά μας δεδομένα επιβεβαίωσαν την παρουσία της θέσης πρόσδεσης α2(+)/α2(-) στον α2β2 LS-υπότυπο και επικύρωσαν τη λειτουργική σημασία συγκεκριμένων αμινοξικών καταλοίπων στις α2 και β2 υπομονάδες του nAChR. Δεδομένης της παθολογικής σημασίας της α2 υπομονάδας του nAChR και της υψηλής ομολογίας της με την υπομονάδα α4 (78%) και με άλλες υπομονάδες νευρωνικών nAChR, τα ευρήματα αυτά παρέχουν πολύτιμες πληροφορίες για τη μοντελοποίηση αρκετών nAChRs και επιτρέπουν το σχεδιασμό ειδικών φαρμάκων, βασισμένων στη δομή, έναντι ασθενειών σχετιζόμενων με τους nAChRs. Επιπλέον των παραπάνω, συμμετείχα σε δύο εργασίες που έγιναν σε συνεργασία με τις ερευνητικές ομάδες των Δρ Ρ. Μάτσα και Δ. Θωμαΐδου στο Ελληνικό Ινστιτούτο Παστέρ. H πρώτη αφορούσε σε σωματικά κύτταρα που αποδιαφοροποιήθηκαν και στη συνέχεια τους δόθηκε νευρωνικός προσανατολισμός (iPSCs derived neurons) για την έρευνα της νόσου Parkinson, και η δεύτερη αφορούσε τον επαναπρογραμματισμό των αστροκυττάρων και MEFs σε νευρώνες. Η νόσος Parkinson (PD) είναι μια ανίατη νευροεκφυλιστική διαταραχή που χαρακτηρίζεται από κινητικά και μη κινητικά ελλείμματα, συμπεριλαμβανομένης της νοητικής πτώσης και της άνοιας. Η πρωτεΐνη α-συνουκλεΐνη συνδέεται έντονα με την παθογένεια της PD, ενώ οι μεταλλάξεις της α-συνουκλεΐνης, όπως η σημειακή μετάλλαξη ρ.Α53Τ, προκαλούν οικογενείς μορφές PD. Η συμβολή μου σε αυτή τη μελέτη έγινε με την άντληση ηλεκτροφυσιολογικών δεδομένων, προκειμένου να αξιολογηθούν κατά πόσο οι επαγόμενοι νευρώνες είχαν φθάσει σε τέτοια ωρίμανση ώστε να μπορούν να έχουν τις ηλεκτρικές ιδιότητες νευρώνων. Τα ευρήματα μας έδειξαν ότι οι επαγόμενοι νευρώνες πράγματι είχαν ηλεκτρικές ιδιότητες νευρώνων.Τέλος, στη δεύτερη εργασία παρουσιάστηκαν ηλεκτροφυσιολογικά δεδομένα όπου καταδεικνύουν ότι υπερέκφραση του Cend1 συνεργιστικά με την neurogenin 2, σε υψηλά επίπεδα, οδηγεί τα νευρικά βλαστικά/προγονικά κύτταρα σε έξοδο από τον κυτταρικό κύκλο και διαφοροποίηση ειδικά προς το νευρωνικό φαινότυπο. Έτσι, η ηλεκτροφυσιολογική μελέτη των κυττάρων αυτών έδειξε ότι τα κύτταρα αυτά παρουσίασαν ηλεκτρικές ιδιότητες νευρώνων.