Η ανοσολογική ταυτότητα εντός του όγκου και στο περιφερικό αίμα ως βιοδείκτες πρόγνωσης στον καρκίνο του μαστού

Abstract

The purpose of this thesis was to study the infiltration level and the spatial distribution of the immune cell subpopulations within the tumor, as well as the level of their correlation with clinicoopathological characteristics and the clinical outcome of patients with invasive, non-metastatic, ductal breast cancer (BCa). Furthermore, we studied the possible correlations between circulating factors at the preoperative stage and tumor infiltration status by immune cells, in order to create a combinational signature of prognostic significance.The study is divided in three parts. The first part includes the total number of patients with breast cancer (BCa). The second part includes patients with available follow-up that were analyzed retrospectively. Finally, the third part is a prospective cohort of patients, with an additional blood sample collected one day before operation.In the total number of patients, tests were carried out in tissue specimens to evaluate the presence, as well as the spatial-architectural distribution of immune cell subpopulations in the tumor center (TC) or in the invasive margin (IM), or/and in both. The results from differential tumor infiltration by CD8+ lymphocytes and CD163+ macrophages in a group of 162 patients were correlated with established BCa clinicopathological features, such as TNM stage, Grade, Hormone Receptors status, HER2/neu over-expression, proliferation marker Ki67% and patient age. From our results, it was demonstrated for the first time that the combined evaluation of CD8+ or/and CD163+ cell densities in TC and IM improves patients’ categorization and increases the prognostic value of the established TNM staging in BCa.In the retrospective part of the study, 97 patients with available clinical follow-up were analyzed. Our data indicated that the combined assessment of the CD8+ and CD163+ cell densities in TC and IM could enhance the prognostic accuracy of disease-free survival-DFS and overall survival-OS. More specifically, two “signatures” were created, a favorable one –FCIS (Favorable Combined Immune Signatures) characterized by high CD8+ in TC and low in IM and/or low CD163+ in TC and high in IM and an unfavorable one -UCIS (Unfavorable Combined Immune Signatures) characterized by low CD8+ in TC and high in IM or high CD163+ in TC and low in IM (without being CD8+ HL or CD163+ LH). These two signatures cover approximately 50% of the patients with invasive, non-metastatic ductal BCa. The other patients remain at a “gray area” (REST).At the prospective part of the study, six miRNAs levels, from serum and Peripheral Blood Mononuclear Cells-PBMCs, of 50 patients were evaluated. Furthermore, the expression levels of circulating cytokines/ chemokines were measured. Direct correlations, positive and negative, were revealed between circulating miRNAs and tumor infiltrated immune cell subpopulations, as well as with some cytokines/chemokines level. No correlation was observed between serum miRNAs of PBMCs miRNAs.Using an algorithm, three distinguishable clusters of patients were created based on their serum-derived miRNA expression levels. There was a classification of patients with different clinicopathological characteristics, different levels of circulating cytokines/chemokines, different immune cell infiltration and a different HLA genotype. Taking into account the limitations set in our study regarding the small sample size, we could argue that we have identified for the first time a "signature" that easily and with a minimally invasive method segregates patients with invasive, non-metastatic BCa into three different clusters with distinctive features. In addition, some of the clusters/groups, that have been created, seem to have a diagnostic role as well. These "signatures" remain to be confirmed in a larger sample of patients. Beside this, clinical follow-up over a period of time is essential to verify whether the factors measured in the peripheral blood, alone or in combination with the tumor microenvironment, could serve as a "liquid biopsy" and/or as a "signature" with the immune cell infiltration of the tumor giving at the time of the initial diagnosis an additional prognostic value to our "signature".

Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν η μελέτη του βαθμού διήθησης και της χωροταξικής κατανομής ανοσοκυτταρικών υποπληθυσμών στον όγκο και κατά πόσο σχετίζονται με τα κλινικοπαθολογικά χαρακτηριστικά και την κλινική πορεία ασθενών με πορογενή, διηθητικό, μη μεταστατικό καρκίνο του μαστού. Ένας επιπλέον στόχος της μελέτης αυτής ήταν η πιθανή συσχέτιση κυκλοφορούντων παραγόντων προεγχειριτικά με την εικόνα διήθησης του όγκου από ανοσοκύτταρα και προσπάθεια δημιουργίας συνδυαστικής προγνωστικής υπογραφής που θα ενσωματώνει όλα ή μέρος των στοιχείων που προέκυψαν από την μελέτη.Η μελέτη χωρίζεται σε τρία τμήματα. Το πρώτο τμήμα αφορά στο σύνολο των ασθενών με καρκίνο του μαστού (ΒCa) που μελετήσαμε, το δεύτερο σε αναδρομικό τμήμα της μελέτης όπου τα ευρήματά μας συσχετίστηκαν με στοιχεία από την κλινική παρακολούθηση των ασθενών, που είχαμε στη διάθεσή μας και το τρίτο τμήμα αφορά σε ένα προοπτικό τμήμα της μελέτης, όπου έγινε επιπλέον αιμοληψία μια ημέρα πριν το χειρουργείο ασθενών. Όσον αφορά στο σύνολο των ασθενών, εξετάστηκε η παρουσία ανοσοκυτταρικών υποπληθυσμών είτε στο κέντρο του όγκου (Tumor Center, TC), είτε στο διηθητικό μέτωπο (Invasive Margin, IM), ή/και στα δύο και μελετήθηκε ο ρόλος της χωροταξικής-αρχιτεκτονικής κατανομής των κυττάρων αυτών σε ιστολογικά παρασκευάσματα. Σε μία ομάδα 162 ασθενών, οι πληροφορίες που εξήχθησαν από τη διαφορική διήθηση των όγκων από CD8+ λεμφοκύτταρα και CD163+ μακροφάγα συσχετίστηκαν με τα εγκαθιδρυμένα κλινικοπαθολογικά χαρακτηριστικά στον ΒCa, όπως είναι το στάδιο (ΤΝΜ stage), ο βαθμός διαφοροποίησης (Grade), η παρουσία ορμονικών υποδοχέων (Hormone Receptors), η υπερ-έκφραση του ΗER2/neu, ο δείκτης κυτταρικού πολλαπλασιασμού Κi67% και η ηλικία των ασθενών, με στόχο τη διερεύνηση πιθανών συσχετίσεων. Από τα αποτελέσματά μας, προτείνεται για πρώτη φορά ότι η συνδυαστική αξιολόγηση των πυκνοτήτων των ανοσοκυττάρων CD8+ ή/και CD163+ στο κέντρο του όγκου (ΤC) και το διηθητικό μέτωπο (IM) επιτρέπει καλύτερη κατηγοριοποίηση των ασθενών και βελτιώνει την προγνωστική αξία της εγκαθιδρυμένης σταδιοποίησης κατά TNM στον καρκίνο του μαστού.Το αναδρομικό τμήμα της μελέτης αφορούσε 97 ασθενείς για τους οποίους είχαμε διαθέσιμα στοιχεία από την κλινική παρακολούθηση. Τα δεδομένα μας υπέδειξαν ότι η συνδυαστική αξιολόγηση των πυκνοτήτων των κυττάρων CD8+ και CD163+ από κοινού στο TC και στο IM μπορούν να βελτιώσουν την ακρίβεια της πρόβλεψης για την ελεύθερη νόσου επιβίωση (DFS) και τη συνολική επιβίωση (OS). Συγκεκριμένα δημιουργήθηκαν δύο «υπογραφές», η ευνοϊκή- Favorable Combined Immune Signatures-FCIS, που χαρακτηρίζεται από υψηλά CD8+ στο TC και χαμηλά στο IM και/ή χαμηλά CD163+ στο TC και υψηλά στο ΙΜ και η δυσμενής-Unfevorable Combined Immune Signatures-UCIS, που χαρακτηρίζεται από χαμηλά CD8+ στο TC και υψηλά στο ΙΜ, ή υψηλά CD163+ στο ΤC και χαμηλά στο ΙΜ (χωρίς να είναι CD8+ HL ή CD163+ LH). Οι δύο αυτές υπογραφές καλύπτουν το 50% περίπου των ασθενών με μη μεταστατικό πορογενή διηθητικό καρκίνο του μαστού. Οι υπόλοιπες ασθενείς παραμένουν σε μια «γκρίζα ζώνη» (REST).Στο προοπτικό τμήμα της μελέτης μελετήθηκαν τα επίπεδα έξι miRNAs στον ορό 50 ασθενών και στα Peripheral Blood Mononuclear Cells-PBMCs τους. Επίσης, μελετήθηκαν και τα επίπεδα έκφρασης κυκλοφορούντων κυτταροκινών/ χημειοκινών. Απευθείας συσχετίσεις, θετικές ή αρνητικές, αποκαλύφθηκαν μεταξύ κυκλοφορούντων miRNAs και διήθησης του όγκου από ανοσοκύτταρα, αλλά και με τα επίπεδα ορισμένων κυτταροκινών/χημειοκινών, ενώ δεν παρατηρήθηκε συσχέτιση με τα miRNAs των PBMCs. Με τη βοήθεια αλγορίθμου, επιτράπηκε η δημιουργία τριών διακριτών συστάδων/clusters ασθενών βάσει των επιπέδων έκφρασης των miRNAs από τον ορό τους. Προέκυψε λοιπόν μία κατηγοριοποίηση ασθενών με διαφορετικά κλινικοπαθολογικά χαρακτηριστικά, διαφορετικά επίπεδα κυκλοφορούντων κυτταροκινών/ χημειοκινών, διαφορετική διήθηση από ανοσοκύτταρα και διαφορετικό HLA γονότυπο. Λαμβάνοντας πάντα υπόψη τους περιορισμούς που τίθενται στη μελέτη μας όσον αφορά στο μικρό μέγεθος δείγματος, μπορούμε να υποστηρίξουμε πως έχουμε μια «υπογραφή» που για πρώτη φορά, εύκολα και ελάχιστα παρεμβατικά διαχωρίζει τους ασθενείς με διηθητικό, μη μεταστατικό καρκίνο του μαστού σε τρεις διαφορετικές συστάδες με διακριτά χαρακτηριστικά. Επιπλέον κάποιες από τις συστάδες/ ομάδες που δημιουργήθηκαν φαίνεται να έχουν και διαγνωστικό ρόλο. Οι «υπογραφές» αυτές μένει να επιβεβαιωθούν σε μεγαλύτερο δείγμα ασθενών και με την πάροδο του χρόνου, όταν θα έχουμε την κλινική παρακολούθηση των ασθενών αυτών, ώστε να μπορούμε να ελέγξουμε κατά πόσο η «εικόνα» που έχουμε από το περιφερικό αίμα, με τους παράγοντες που προτείνουμε για μελέτη, είτε από μόνοι τους ή σε συνδυασμό με το μικροπεριβάλλον του όγκου, θα μπορούσαν να χρησιμεύσουν ως «υγρή βιοψία» ή/και ως συνδυαστικές «υπογραφές» με την ανοσοκυτταρική διήθηση του όγκου, δίνοντας κατά την αρχική διάγνωση και προγνωστική αξία στην «υπογραφή» μας.