Μελέτη βιοχημικών, καταλυτικών και δομικών μεταβολών φυτικών ενζύμων σε συνθήκες υπερυψηλής πίεσης

Abstract

In food industry, the main issue with regards the endogenous plant pectinolytic and proteolytic enzymes is the control of the non desirable pectin hydrolysis during juicing and the control of the extent of proteolysis when applied as milk clotting agents, respectively. The objective of this work was the investigation of the effect of High pressure (HP) on a wide range of PMEs and proteolytic enzymes from various sources. Different behaviour (HP inactivation) was observed for same enzymes of different sources. This was further investigated through structural studies of the inactivated enzymes. The obtained results led to the elucidation of how the structural changes are correlated to residual enzyme activity and the different mechanism that induces inactivation in thermal and HP processing.The results obtained from the HP inactivation of pectinolytic enzymes were used for the implementation of this technology in the production of fruit juices HP processed at optimal conditions. Sea buckthorn juice and Navel cv. orange juice were cold pasteurized at conditions predetermined by mathematical equations considering an at least 90% PME inactivation and retention of antioxidant activity with maximum inactivation of spoilage microorganisms. Validation experiments were conducted through shelf-life tests for both studied juices.The studied proteolytic enzymes were used as milk clotting agents for the development of novel dairy products. The main issue with regards their application is the control of their enzymatic activity after the desired extent of proteolysis. HP was used for further enzymatic activity regulation, based on the kinetics obtained from the inactivation experiments. A variety of products can be produced from yoghurt-type to cheese-type with organoleptic characteristics equivalent and in some cases superior than those of conventional dairy products.Concluding, the inactivation of enzymes such as PMEs and plant proteolytic enzymes, at low or moderate temperatures without changing organoleptic and nutritional properties of food systems in which they are present or can be added, shows that HP technology has the potential to be used in the development of a new generation of value added foods. Some of the results that were obtained in this PhD thesis may be directly applied in the food industry.

Αντικείμενο της παρούσας εργασίας ήταν η μελέτη της επίδρασης τριών παραμέτρων, της πίεσης, της θερμοκρασίας και του χρόνου, στα βιοχημικά, καταλυτικά και δομικά χαρακτηριστικά ενζύμων που προέρχονται από φυτικές πηγές, όπως οι πηκτινομεθυλεστεράσες και οι κυστεϊνικές πρωτεϊνάσες. Για την επίτευξη των στόχων της διδακτορικής διατριβής, πραγματοποιήθηκε αρχικά μελέτη κινητικής απενεργοποίησης των πηκτινολυτικών και πρωτεολυτικών ενζύμων προερχόμενα από διάφορες φυτικές πηγές με την τεχνολογία της ΥΠ. Τα ληφθέντα αποτελέσματα επαλήθευσαν την τάση που φαίνεται σε μελέτες της διεθνούς βιβλιογραφίας, ότι η διαφορετικότητα της πηγής προέλευσης των ενζύμων επηρεάζει σημαντικά τα χαρακτηριστικά της κινητικής απενεργοποίησης αυτών με την τεχνολογία της ΥΠ.Επιλέχθηκαν για περαιτέρω μελέτη της δομής ένζυμα (πηκτινολυτικά και πρωτεολυτικά) με διαφορετική συμπεριφορά κατά την απενεργοποίηση με ΥΠ. Ακολούθησε απομόνωση και καθαρισμός των μελετώμενων ενζύμων με τεχνικές χρωματογραφικού διαχωρισμού. Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε μελέτη των δομικών μεταβολών των καθαρών ενζύμων μετά από επεξεργασία με ΥΠ, καθώς και μετά από θερμική επεξεργασία με τη χρήση της φασματοσκοπίας κυκλικού διχρωισμού. Τα μετουσιωμένα ένζυμα όπως φαίνεται από τα αποτελέσματα της συγκεκριμένης έρευνας διατηρούν τη δευτεροταγή δομή τους ανέπαφη, αλλά παρουσιάζουν «χαλαρότερη» 3D δομή (απώλεια μεγαλύτερου μέρους της τριτοταγούς δομής), απ’ ότι στη φυσική τους κατάσταση. Οι μεταβολές αυτές έχουν επακόλουθη επίπτωση στη σύνδεση υποστρώματος-ενζύμου, οδηγώντας τελικά σε μείωση της δραστικότητάς του.Με χρήση των αποτελεσμάτων που προέκυψαν από τα παραπάνω πειράματα, η τεχνολογία της ΥΠ εφαρμόστηκε για την παραγωγή σε πιλοτική κλίμακα πορτοκαλοχυμού NFC ποικιλίας Navel. Οι βέλτιστες συνθήκες (600 MPa, 40oΗ ΥΠ εφαρμόστηκε για την παραγωγή νέων γαλακτοκομικών προϊόντων με εφαρμογή πρωτεολυτικών ενζύμων (σαν παράγοντες πήξης του γάλακτος). Πιο συγκεκριμένα, χρησιμοποιήθηκαν πέντε διαφορετικά πρωτεολυτικά ένζυμα και προσδιορίστηκε αυτό το οποίο δίνει τις καλύτερες ιδιότητες στο τελικό προϊόν με βάση την οργανοληπτική αποδοχή των προϊόντων, τη σταθερότητα του σε συνθήκες επεξεργασίας και τον ελάχιστο απαιτούμενο χρόνο πήξης. Αξιολογώντας τα αποτελέσματα που προέκυψαν, η ακτινιδίνη ήταν το ένζυμο που παρουσίασε τις καλύτερες ιδιότητες και χρησιμοποιήθηκε ως παράγοντας πήξης για την παραγωγή νέων γαλακτοκομικών προϊόντων σε εργαστηριακή κλίμακα. C για 3 min) για την αποτελεσματική (ψυχρή) παστερίωση του συγκεκριμένου χυμού επιλέχτηκαν με βάση την κατά 90% απενεργοποίηση της ΠΜΕ, τη διατήρηση της αντιοξειδωτικής δράσης του και τη μέγιστη μείωση των αλλοιογόνων μικροοργανισμών. Επαλήθευση των παραπάνω συνθηκών επεξεργασίας πραγματοποιήθηκε με πειράματα διατηρησιμότητας του χυμού. Η ΥΠ μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την παστερίωση και άλλων χυμών, όπως είναι ο χυμός ιπποφαούς, στους οποίους η εφαρμογή της θερμικής επεξεργασίας οδηγεί σε υποβάθμιση της ποιότητάς τους.Συμπερασματικά, η μελέτη της δραστικότητας επεξεργασμένων με ΥΠ πηκτινολυτικών και πρωτεολυτικών ενζύμων συντελεί στην παραγωγή χυμών φρούτων και λαχανικών με βελτιωμένα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά, καθώς και σε γαλακτοκομικά προϊόντα στα οποία τα πρωτεολυτικά ένζυμα θα είναι οι παράγοντες πήξης.