Δομικές και λειτουργικές αλλαγές της πρωτεϊνοσυνθετικής μηχανής στο μύδι Mytilus galloprovincialis μετά από πειραματική έκθεση σε τοξικά μέταλλα

Abstract

Trace metals are common stressors in estuaries, and their importance is increasing due to accumulation of persistent metal pollutants in coastal habitats. Trace metals can interfere with various physiological processes in marine organisms, in particular with protein synthesis. Previous studies have indicated that changes in translation process cover a broad range of potential responses, depending on the idiosyncratic features of each metal. Another factor contributing to the complexity of translational responses is the ability of trace metals to produce reactive oxygen species (ROS) which, in turn may cause structural alterations in components of the ribosome that may modify its functionality. The present study was therefore initiated to determine the impact of oxidative stress caused by exposure of mussels Mytilus galloprovincialis to one of Cu, Hg or Cd, on the integrity of the ribosomal components. Metal accumulation in digestive gland cells of Mytilus galloprovincialis causes oxidative stress, among others, as evidenced by increased lipid peroxidation, changes in GSH levels and strong production of superoxide radicals. This triggers anti-oxidant mechanisms in mussels, represented in our experiment by increased production of Metallothioneins (MTs) and induction of SOD activity.As far as rRNA integrity is concerned, exposure of mussels to Cu and Hg caused time-dependent scissions or modifications in nucleotides, that constitute key positions of interaction with functional centres of the ribosome, like decoding centre and binding sites of translation factors, in a time dependent manner. In contrast, structural impairments in Cd- exposed mussels were initially increased by day 5, but decreased to reach nearly the control values by day 15, indicating that modifications and alterations in the integrity of rRNA go hand in hand with parallel changes in translation efficiency and suggest that structural perturbations constitute the basis of translational alterations.Carbonylated proteins are the major product of protein oxidation and are widely used as a biomarker of oxidative stress. The present study was designed to detect the impact of metal-stress on the carbonylation level of translation factors and ribosomal proteins in digestive glands from mussels exposed to metals as described above. Carbonylation of proteins was estimated by reacting proteins with DNPH and then detecting the resultant products by using an anti-DNPH antibody. As far as carbonylation of translation factors is concerned, a notable increase of protein carbonyl groups was observed in a time-dependent manner for mussels treated with Cu or Hg. Instead, Cd caused an initial increase in the level of carbonylated proteins which receded after prolonged time of exposure. The same trend was observed when ribosomal proteins were analysed, with the note that carbonylation was milder in the latter.Concerning the fraction of translation factors, samples from mussels exposed to any metal for 5 days showed increased levels of the phosphorylated initiation factor eIF2α, which became higher after 15-days of exposure. The same trend of alterations in phosphorylation was observed for the elongation factor eEF2 in mussels exposed to Cu or Hg. Instead, exposure to Cd caused an opposite effect. Notably, the total levels of both factors remained constant throughout the exposure period. Similarly, the expression of the initiation factor eIF4E remained constant during the exposure to Cu or Hg, however, at the 15th day of exposure to Cd it was significantly elevated. Interestingly, the eIF4E-binding proteins (4E-BPs), which inhibit cap-dependent translation, were more phosphorylated at the early than at the late phase of exposure to Cu or Hg. Again, exposure to Cd caused the opposite effect. In conclusion, our results demonstrate that phosphorylation of eIF2α and mTOR signalling network determines the translation machinery decisions in response to metal-stress. Electrophoretic separation of ribosomal proteins as well as proteomic analysis allowed us to conclude that exposure to metals causes significant changes in the expression pattern of ribosomal proteins. Regarding mussels exposed to copper and mercury, 70% of the proteins demonstrated variations in expression in a time-dependent manner. It should be noted that the changes are also related to the nature of metal, since variations in the pattern of the affected proteins have been observed. As for mussels exposed to cadmium, the strongest changes were observed during the first days of exposure. However, after 15 days of exposure, the expression levels returned to almost the original levels seen in reference samples. In all cases, the proteins whose expression is disrupted are important for both ribosome assembly and proper functioning as they participate in functional positions such as the A-site and the P-site, which is reflected on the observed changes in the protein-synthesis capacity of organisms after exposure to metals. Further analysis of the carbonylation of ribosomal proteins by two-dimensional electrophoresis and immunochemical quantification showed a specific carbonylation pattern for each metal, which could potentially be used as an indicator of metal contamination.The results of classical biochemical analyses were confirmed by MS spectroscopy and the oxidative damage of proteins was identified at amino acid level, thus demonstrating the reliability of the experimental protocol followed and enhancing the importance of proteomic analysis in toxicology studies.

Τα παράκτια υδάτινα οικοσυστήματα αποτελούν ένα δυναμικό περιβάλλον, το οποίο επηρεάζεται από πολλούς παράγοντες, μεταξύ των οποίων η ποιότητα του νερού και η ανθρώπινη δραστηριότητα. Ανάμεσα στις χημικές ουσίες που απαντώνται στα θαλάσσια ύδατα και αποτελούν αντικείμενο των οικοτοξικολογικών μελετών λόγω των πιθανών επιπτώσεών τους στο περιβάλλον και τη δημόσια υγεία, ανήκουν τα τοξικά μέταλλα καθώς και τα απαραίτητα μέταλλα, τα οποία όμως γίνονται τοξικά όταν ο συγκεντρώσεις τους υπερβούν κάποια όρια. Ανάμεσα στις προαναφερθείσες κατηγορίες ανήκουν ο χαλκός (Cu), ο υδράργυρος (Hg) και το κάδμιο (Cd), τα οποία χρησιμοποιήθηκαν ως ρύποι στην παρούσα διατριβή σε συγκεντρώσεις 40 μg/L, 30 μg/L και 100 μg/L, αντίστοιχα για περίοδο έκθεσης που κυμάνθηκε από 5 ημέρες, όπου το οξειδωτικό στρες θεωρείται οξύ ή υποχρόνιο, (acute or sub-chronic), έως 15 ημέρες όπου χαρακτηρίζεται ως χρόνιο (chronic). Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι μια άμεση ανταπόκριση των πεπτικών κυττάρων μυδιών Mytilus galloprovincialis εκτεθειμένων σε μέταλλα, είναι η αναστολή της πρωτεϊνικής σύνθεσης. Όμως, ορισμένα γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες διευκολύνουσες την προσαρμογή των κυττάρων στο στρες από μέταλλα, μεταφράζονται αποδοτικά. Η παρούσα μελέτη σχεδιάστηκε για να προσδιορίσει τη συσχέτιση μεταξύ του προκαλούμενου οξειδωτικού στρες και της επαγόμενης πτώσης της πρωτεϊνοσύνθεσης, με τις δομικές αλλοιώσεις, τις οποίες υφίστανται τα συστατικά της πρωτεΐνοσυνθετικής μηχανής. Κατ΄ αρχάς έγινε εκτίμηση ορισμένων κλασικών δεικτών καταπόνησης υπό την επίδραση των τριών μετάλλων, όπως μέτρηση συχνότητας μικροπυρήνων, χρόνου αποσταθεροποίησης λυσσοσωματικής μεμβράνης, υπεροξείδωσης λιπιδίων, παραγόμενου σουπεροξειδίου και εκτίμηση οξειδωτικής βλάβης στο DNA και το RNA μέσω προσδιορισμού της 8-ΟΗdG και 8-OHG. Ακόμη, μελετήθηκαν τα επίπεδα αντιοξειδωτικών μορίων που περιλαμβάνουν τη σουπεροξειδική δισμουτάση, τη γλουταθειόνη και τις μεταλλοθειονίνες. Κατόπιν της εκτίμησης του οξειδωτικού προφίλ των μυδιών, η μελέτη επικεντρώθηκε στη διερεύνηση των αλλοιώσεων που προκαλούνται στο ριβοσωματικό RNA, μετά από έκθεση σε μέταλλα. Η ανάλυση που έγινε στα μόρια 5S και 18S, έδειξε την παρουσία θραύσεων και τροποποιήσεων σε περιοχές των μορίων οι οποίες σχηματίζουν λειτουργικά κέντρα του ριβοσώματος, όπως το κέντρο αποκωδικοποίησης. Η έκθεση σε χαλκό και υδράργυρο προκάλεσε παρόμοια αποτελέσματα με τη μέγιστη βλάβη να παρατηρείται στις 15 ημέρες έκθεσης, ενώ αντίθετα οι μεγαλύτερες αλλοιώσεις στην περίπτωση του καδμίου προκλήθηκαν στις 5 ημέρες, με το φαινόμενο να αντιστρέφεται σε χρόνια έκθεση, λόγω της επαγωγής αντιοξειδωτικών μηχανισμών, όπως η δράση μεταλλοθειονινών και της γλουταθειόνης. Οι διαταραχές που παρατηρήθηκαν δείχνουν την ίδια τάση με αυτήν της πρωτεΐνοσυνθετικής ικανότητας των μυδιών, δείχνοντας έτσι ότι οι δομικές αλλαγές του ριβοσώματος αποτελούν τη βάση για τις μεταφραστικές αποκρίσεις στο στρες. Κατόπιν, η μελέτη επικεντρώθηκε στις ριβοσωματικές πρωτεΐνες και τους μεταφραστικούς παράγοντες. Οι καρβονυλιωμένες πρωτεΐνες είναι το κύριο προϊόν της οξείδωσης των πρωτεϊνών και χρησιμοποιούνται ευρέως ως δείκτες οξειδωτικού στρες. H μέτρησή τους βασίζεται στην ιδιότητα των κετονών ή αλδεϋδών να αντιδρούν με 2,4-δινιτροφαινυλυδραζίνη (DNPH) ως εκ τούτου με τη χρήση anti-DNP αντισώματος μπορούν να προσδιοριστούν και να ποσοτικοποιηθούν οι καρβονυλιωμένες πρωτεΐνες στα κυτταρικά εκχυλίσματα. Όσον αφορά τους μεταφραστικούς παράγοντες σε δείγματα μυδιών κατεργασμένων με Cu ή Hg, παρατηρήθηκε αξιοσημείωτη αύξηση του βαθμού καρβονυλίωσης κατά χρονο-εξαρτώμενο τρόπο. Aντίθετα, το Cd προκάλεσε αρχικά αύξηση στα επίπεδα καρβονυλίωσης, που στη συνέχεια υποχώρησε. Το ίδιο παρατηρήθηκε όταν αναλύθηκαν ολικές ή ριβοσωματικές πρωτεΐνες, με τη σημείωση ότι η καρβονυλίωση ήταν ηπιότερη στις τελευταίες.Όμως δεδομένου ότι εκτός από την οξειδωτική βλάβη, τα επίπεδα έκφρασης των πρωτεϊνών μεταβάλλονται μετά από έκθεση σε μέταλλα, προσδιορίστηκαν επίσης και οι μεταβολές στα επίπεδα έκφρασης των προαναφερθέντων.Όσον αφορά στους μεταφραστικούς παράγοντες, που εμπλέκονται στην έναρξη και επιμήκυνση της πρωτεϊνικής σύνθεσης, δεδομένου ότι ρυθμιστικοί μηχανισμοί παρεμβαίνουν συνήθως κατά τη διάρκεια αυτών των μεταφραστικών φάσεων, τα αποτελέσματα ήταν τα εξής. Υπό την επίδραση Cu και Hg, τα επίπεδα του φωσφορυλιωμένου παράγοντα έναρξης eIF2α, έδειξαν αύξηση, η οποία εντάθηκε περαιτέρω κατά τη 15η ημέρα δειγματοληψίας. Η ίδια τάση αλλαγών στη φωσφορυλίωση παρατηρήθηκε για τον παράγοντα επιμήκυνσης eEF2 σε μύδια εκτεθειμένα στα μέταλλα. Όμως, έκθεση σε Cd προκάλεσε αντίθετο αποτέλεσμα. Πρέπει να σημειωθεί, ότι τα συνολικά επίπεδα αμφοτέρων των παραγόντων παρέμεναν σταθερά σε όλη τη διάρκεια έκθεσης. Παρομοίως, η έκφραση του παράγοντα έναρξης eIF4E παρέμενε σταθερή κατά την έκθεση σε Cu ή Hg, όμως αυξάνονταν σημαντικά κατά τη 15η ημέρα έκθεσης σε Cd. Είναι ενδιαφέρον ότι οι eIF4E-δεσμευόμενες πρωτεΐνες (4E-BPs), οι οποίες αναστέλλουν την cap-εξαρτώμενη μετάφραση, βρέθηκαν περισσότερο φωσφορυλιωμένες στα πρώιμα, παρά στα παρατεταμένα στάδια έκθεσης σε Cu ή Hg. Έκθεση σε Cd προκάλεσε πάλι το αντίθετο φαινόμενο. Συμπερασματικά, τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι η φωσφορυλίωση του eIF2α και το δίκτυο σηματοδότησης mTOR καθορίζουν τις μεταφραστικές ανταποκρίσεις στο στρες από βαρέα μέταλλα. Τέλος, η έκθεση σε μέταλλα, προκάλεσε σημαντικές αλλαγές στο πρότυπο έκφρασης των ριβοσωματικών πρωτεϊνών. Όσον αφορά στα μύδια που εκτέθηκαν σε χαλκό και υδράργυρο, στο 70% των πρωτεϊνών παρατηρήθηκαν αυξομειώσεις της έκφρασης με το φαινόμενο να είναι χρονοεξαρτώμενο, δηλαδή εντονότερο στις 15 ημέρες έκθεσης. Θα πρέπει να σημειωθεί ότι οι μεταβολές σχετίζονται και με το μέταλλο έκθεσης, αφού παρατηρήθηκαν διαφοροποιήσεις ως προς την ταυτότητα των επηρεαζόμενων πρωτεϊνών. Όσον αφορά στα μύδια που εκτέθηκαν σε Cd, οι πιο έντονες αλλαγές παρατηρήθηκαν τις πρώτες ημέρες έκθεσης. Όμως μετά την πάροδο των 15 ημερών έκθεσης, τα επίπεδα έκφρασης, επανήλθαν σχεδόν στα αρχικά επίπεδα που παρατηρούνται στα μύδια αναφοράς. Σε όλες όμως τις περιπτώσεις, οι πρωτεΐνες των οποίων η έκφραση διαταράχθηκε, είναι σημαντικές τόσο για τη συγκρότηση του ριβοσώματος όσο και για την εύρυθμη λειτουργία του καθώς συμμετέχουν σε λειτουργικές θέσεις, όπως η Α-θέση και η Ρ-θέση της μικρής ριβοσωματικής υπομονάδας, γεγονός που συνδέεται με τις παρατηρούμενες αλλαγές της πρωτεΐνοσυνθετικής ικανότητας των οργανισμών μετά από έκθεση σε μέταλλα. Περαιτέρω ανάλυση της καρβονυλίωσης των ριβοσωματικών πρωτεϊνών με ηλεκτροφόρηση δυο διαστάσεων και ανοσοχημική ποσοτικοποίηση έδειξε εξειδικευμένο πρότυπο καρβονυλίωσης για κάθε μέταλλο, το οποίο ενδεχομένως θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί ως δείκτης της ρύπανσης από μέταλλα.Τα αποτελέσματα των κλασικών βιοχημικών αναλύσεων επιβεβαιώθηκαν με MS φασματοσκοπία και οι οξειδωτικές βλάβες των πρωτεϊνών ταυτοποιήθηκαν σε επίπεδο αμινοξέων, αναδεικνύοντας έτσι την αξιοπιστία του ακολουθούμενου πειραματικού πρωτοκόλλου και ενισχύοντας τη σημασία της πρωτεομικής ανάλυσης σε τοξικολογικές μελέτες.