Γεωγραφική διαφοροποίηση και γενετική ποικιλότητα πληθυσμών χερσόβιων ισοπόδων

Abstract

Terrestrial isopods (Oniscidea) represent a monophyletic suborder of the order Isopoda (Crustacea, Malacostraca, Peracarida). They are the only group of crustaceans fully adapted to live on land and occur in all the ecosystems from sea level to high mountains, from forests to deserts, excluding the polar areas. The majority of terrestrial isopods need a high degree of air humidity for survival, due to their limited ability to preserve water. The genus Trachelipus comprises of relatively stenoecious animals living in habitats generally threatened by human activities, such as humid forest sites and riparian habitats. It includes some 50 species distributed around the Palaearctic, with 8 species recorded from Greece, 4 endemic to the country (i.e. Greek endemics: T. palustris, T. aegaeus, T. cavaticus, T. n. sp.; European species: T. camerani, T. squamuliger, T. ratzauti, T. arcuatus). The distribution of species is discontinuous due to the increasing fragmentation of its habitats and the expansion of agricultural land and dry woodland. Projected climatic change will restrict further gene flow between Trachelipus populations, as dry habitats are expected to expand in Greece. The phylogenetic relationships among these animals are still largely unknown because robust analyses have started to appear only relatively recently. Species-level taxonomy has been based mainly on a few secondary sexual characters of males, although recent analyses based on molecular markers have indicated that species definitions based on morphology may underestimate the true levels of divergence among populations. Furthermore, within several genera or species groups, morphological characters do not provide clear-cut taxonomic resolution, so that many changes in the interpretation of nominal species have appeared in the literature. In my PhD Thesis I performed a phylogenetic analysis of Trachelipus spp. distributed in Greece using a population by population approach. I have sampled 123 populations from several sites in mainland and insular Greece and I have also incorporated samples of European origin in order to check both for the morphological and the genetic homology. My main goal was to study the phylogeny of these species, to reveal any possible geographical and/or palaeogeographical pattern and to particularize the distribution of each species within the Greek territory in order to better estimate possible geographic structure in the patterns of divergence among populations, and to throw new light in their systematics. After total DNA extraction, I employed three DNA markers; the mitochondrial 16S rRNA and the Cytochrome Oxidase subunit I, that are widely used for the phylogenetic studies at the species and the population level, and the nuclear sodium-potassium ATPase a-subunit, which is a P-type ATPase ion co-transporter responsible for maintaining electrochemical potential differences across cell membranes, and is essential for cell signalling and secondary transport. Due to the poor preservation of several specimens, I propose a modified DNA extraction protocol, which returned highly positive results in terms of the quality of the total extracted DNA. After PCR amplification of the gene markers I calculated the genetic divergence within and among the populations and species studied, as well as their phylogenetic relationships. The methods for phylogenetic reconstruction that I used were Maximum Parsimony (MP), Maximum Likelihood and Bayesian Inference (BI) for each sequence data and the concatenated datasets. In order to evaluate the biogeographic history and to estimate the chronology of diversification events among the species and their populations I have implement a calibrated molecular clock using 12 alternative scenarios in BEAST [(i.e. palaeogeographical events such as the formation of the Mid- Aegean Trench 12-9 mya and the Messinian Salinity Crisis 5,971 - 5,33 mya), different tree priors (i.e. birth-death process; Yule process), different clocks (strict, Uncorrelated Exponential Relaxed Clock and Uncorrelated Lognormal relaxed clock) and different rates of substitution for COI and 16S rRNA markers (COI = 1.56%-1.72% after Poulakakis & Sfenthourakis 2008; 16Sr RNA = 0,14% after Held 2001)]. The different scenarios implemented where tested and ranked using the Maximum Likelihood Estimators as they were calculated using the path sampling and stepping stone analyses. Αll phylogenetic methods (MP, ML, BI) - produced trees with quite congruent topologies that reveal incongruence with current taxonomy. Some populations that are considered conspecific exhibit large genetic distances and cluster in different clades. The most prominent example is that of T. palustris’ populations that cluster into three different clades that exhibit very large genetic divergence (Kimura 2-p) in all three genetic markers used (COI= 27.2%; 16S rRNA=15.2%; NaK ATPase=4.3% ). In general, it can be argued that the genetic distances recorded in the present study are quite large compared with those reported for different species and even genera in other studies of terrestrial isopods. On the other hand, the Cretan populations that belong to T. cavaticus and T. aegaeus are clustered together and exhibit low genetic distances (COI: 12.3%, 16S rRNA: 6.4%, NaK: 2.9%). Under the light of these results, a revision of the Greek Trachelipus species taxonomical status is in need. The results of my Thesis corroborate the possibility of probably two cryptic species for the “T. palustris” populations; one would include the populations distributed to N. Evia and the peninsula of Magnisia and the second would apply to the populations distributed to the N-NW Peloponnese and Western Greece area. On the other hand the results of my Thesis point to the merger of Cretan populations of Τ. cavaticus and T. aegaeus to a single species (this would be T. aegaeus since it has priority). The highly-structured phylogenetic trees agree with the palaeogeographic history of the Greek territory since the Miocene (23,03 mya). The distribution of the species seem to follow the tectonic and kinematic reconstruction of the Aegean region of Greece and western Turkey depicting the linkage between the subduction-related mountain building, continental extension, and the resulting formation and exhumation of metamorphic rocks to plate motions and mantle dynamics in the area. The chronology results of the clades also corroborate to the geological events and the reconstruction of the Greek territory that account for the today’s geography and geology of the region. My Thesis comprises the first comprehensive phylogenetic study of terrestrial crustacean populations in Greece with positive results concerning the delineation of both the distributional range and the phylogeography of these animals with respect to the palaeogeographic history and the current geography of insular and mainland Greece. Both the phylogeny presented in my Thesis and the genetic distances separating the populations appear to justify the necessity of further investigation into the systematics of the Greek Trachelipus species. My study brought evidence that morphology inadequately describes the real variation inside and among species. Hence, diagnoses based on the morphological characters used so far for the delineation of Trachelipus species should be reconsidered under the light of these more extensive molecular phylogenetic analyses.

Τα χερσόβια ισόποδα (Oniscidea) αντιπροσωπεύουν έναν μονοφυλετικό κλάδο της τάξης ισοπόδων (Crustacea, Malacostraca, Peracarida). Είναι η μόνη ομάδα καρκινοειδών που έχουν πλήρως προσαρμοστεί να ζουν στη στεριά, με εξάπλωση σε όλα τα ενδιαιτήματα. Εμφανίζονται από το επίπεδο της θάλασσας έως και σε ψηλά υψόμετρα, από τα δάση μέχρι και στις ερήμους, με εξαίρεση τις πολικές περιοχές. Η πλειοψηφία των χερσόβιων ισοπόδων χρειάζεται ένα υψηλό βαθμό υγρασίας του αέρα για την επιβίωσή της, εξαιτίας της περιορισμένης δυνατότητάς τους να διατηρήσουν το νερό. Το γένος Trachelipus περιλαμβάνει σχετικά στενόοικους οργανισμούς οι οποίοι διαβιούν σε οικοτόπους που υπόκεινται σε απειλή λόγω των ανθρώπινων δραστηριοτήτων, όπως τα υγρά δάση και οι παρόχθιες διαπλάσεις. Περιλαμβάνει περί τα 50 είδη που εξαπλώνονται σε όλη την Παλαιαρκτική, με 8 είδη να έχουν καταγραφεί στην Ελλάδα, 4 εκ των οποίων είναι ενδημικά στη χώρα (ελληνικά ενδημικά: Τ. palustris, Τ. aegaeus, Τ. cavaticus, Τ. n. sp., ευρωπαϊκά είδη: Τ. camerani Τ, Τ. squamuliger, Τ. razzauti, Τ. arcuatus). Η κατανομή των ειδών είναι ασυνεχής λόγω του αυξανόμενου κατακερματισμού των ενδιαιτημάτων τους και της επέκτασης της γεωργικής γης και της αποψίλωσης των δασών. Η επίδραση της προϊούσας κλιματικής αλλαγής ενδέχεται να περιορίσει περαιτέρω τη ροή γονιδίων μεταξύ των πληθυσμών Trachelipus, καθώς τα ξηρά ενδιαιτήματα αναμένεται να αυξηθούν στην Ελλάδα. Οι φυλογενετικές σχέσεις μεταξύ αυτών των οργανισμών είναι ακόμη σε μεγάλο βαθμό άγνωστες καθώς πιο συστηματικές αναλύσεις έχουν αρχίσει να διενεργούνται σχετικά πρόσφατα. Η διάκριση μεταξύ των ειδών έχει γίνει βάσει περιορισμένου αριθμού δευτερευόντων φυλετικών μορφολογικών χαρακτήρων των αρσενικών ατόμων, ωστόσο οι πρόσφατες αναλύσεις με μοριακούς δείκτες καταδεικνύουν ότι η ταξινόμηση των ειδών με βάση τη μορφολογία μπορεί να υποτιμά τα πραγματικά επίπεδα της απόκλισης μεταξύ των πληθυσμών. Επιπλέον, μέσα σε διάφορα γένη ή ομάδες ειδών, οι χρησιμοποιούμενοι μορφολογικοί χαρακτήρες δεν παρέχουν σαφή ταξινομική ανάλυση, κι έτσι έχουν παρουσιαστεί πολλές αλλαγές στην ονοματολογία των περιγεγραμμένων ειδών στη βιβλιογραφία. Ο κύριος στόχος της διατριβής ήταν η μελέτη των φυλογενετικών σχέσεων μεταξύ των ειδών, η διαπίστωση κάποιου ενδεχόμενου γεωγραφικού ή/και παλαιογεωγραφικού προτύπου και η αποσαφήνιση της κατανομής κάθε είδους εντός της ελληνικής επικράτειας, προκειμένου να εκτιμηθεί καλύτερα μια πιθανή γεωγραφική δομή στα πρότυπα της απόκλισης μεταξύ των πληθυσμών, και να επανεξεταστεί η συστηματική τους. Μετά την απομόνωση ολικού DNA, χρησιμοποίησα τρεις μοριακούς δείκτες: τους μιτοχονδριακούς δείκτες 16S rRNA και την υπομονάδα Ι της κυτοχρωμικής οξειδάσης, οι οποίοι χρησιμοποιούνται ευρέως για τις φυλογενετικές μελέτες στο διαειδικό και ενδοειδικό επίπεδο, και τον πυρηνικό γενετικό τόπο της α-υπομονάδας της αντλίας NaK (NaK ATPase a-subunit), η οποία είναι μία Ρ-τύπου αντλία, συμμεταφορέας ιόντων για τη διατήρηση της διαφοράς του ηλεκτροχημικού δυναμικού μεταξύ των κυτταρικών μεμβρανών, και είναι απαραίτητη για την κυτταρική σηματοδότηση και τη δευτερογενή μεταφορά. Λόγω της κακής συντήρησης αρκετών δειγμάτων, προτείνω ένα τροποποιημένο πρωτόκολλο απομόνωσης DNA, το οποίο έδωσε πολύ θετικά αποτελέσματα αναφορικά με την ποιότητα του απομονωμένου DNA. Μετά τον πολλαπλασιασμό των τριών γενετικών δεικτών με τη μέθοδο της PCR, υπολόγισα τις γενετικές αποστάσεις εντός και μεταξύ των μελετηθέντων πληθυσμών και ειδών, καθώς και τις μεταξύ τους φυλογενετικές σχέσεις. Για τη φυλογενετική ανασύσταση χρησιμοποίησα τις μεθόδους της Μέγιστης Φειδωλότητας (MP), της Μέγιστης Πιθανοφάνειας (ML) και της Μπεϊεσιανής Συμπερασματολογίας (BI) για κάθε γενετικό τόπο και για τις συνδυασμένες αναλύσεις. Προκειμένου να αξιολογηθεί η βιογεωγραφική ιστορία και να εκτιμηθεί η χρονολόγηση των γεγονότων διαφοροποίησης μεταξύ των ειδών και των πληθυσμών, εφάρμοσα ένα βαθμονομημένο μοριακό ρολόι εξετάζοντας 12 εναλλακτικές υποθέσεις με το πρόγραμμα BEAST [α: παλαιογεωγραφικά γεγονότα (όπως η διαμόρφωση της Μεσαιγαιακής Τάφρου 12-9 εκ. χρόνια πριν και η κρίση αλατότητας κατά το Μεσσήνιο 5,971 - 5,33 εκ. χρόνια πριν), β: διαφορετικές παραμέτρους δέντρων (tree priors: διαδικασία της γέννησης-θανάτου, διαδικασία Yule), γ: διαφορετικά ρολόγια (σταθερό μοριακό ρολόι, μη συσχετιζόμενο λογαριθμικό μοντέλο μη σταθερού ρυθμού εξέλιξης, μη συσχετιζόμενο εκθετικό μοντέλο μη σταθερού ρυθμού εξέλιξης) και δ: διαφορετικούς ρυθμούς υποκατάστασης για τoυς μιτοχονδριακούς δείκτες COI και 16S rRNA (COI = 1,56% -1,72% Poulakakis & Sfenthourakis 2008, 16Sr RNA = 0,14% Held 2001). Οι διαφορετικές υποθέσεις που δοκιμάστηκαν κατατάχθηκαν με βάση τους οριακούς εκτιμητές πιθανοφάνειας που υπολογίστηκαν με τις μεθόδους Path Sampling και Stepping Stone. Όλες οι φυλογενετικές μέθοδοι (MP, ML, BI) - κατέληξαν σε δέντρα με κοινές τοπολογίες κλάδων και καταδεικνύουν ασυμφωνία με την ισχύουσα ταξινόμηση. Ορισμένοι πληθυσμοί που θεωρούνται πως ανήκουν στο ίδιο είδος παρουσιάζουν μεγάλες γενετικές αποστάσεις και ομαδοποιούνται σε διακριτούς κλάδους. Το πιο χαρακτηριστικό παράδειγμα είναι αυτό των πληθυσμών του είδους Τ. palustris που ομαδοποιούνται σε τρεις διαφορετικούς κλάδους με πολύ μεγάλη γενετική απόσταση (Kimura 2-P) και στους τρεις γενετικούς δείκτες που χρησιμοποιήθηκαν (COI = 27,2%, 16S rRNA = 15,2%, NaK ΑΤΡ = 4,3%). Σε γενικές γραμμές, οι γενετικές αποστάσεις που καταγράφονται στην παρούσα μελέτη είναι αρκετά μεγάλες σε σύγκριση με εκείνες που έχουν αναφερθεί για τα διάφορα είδη και γένη, ακόμη και σε άλλες μελέτες χερσόβιων ισοπόδων. Από την άλλη πλευρά, διαφορετικοί πληθυσμοί από την Κρήτη που ανήκουν στα είδη Τ. cavaticus και Τ. aegaeus, ομαδοποιούνται μαζί και παρουσιάζουν μικρές γενετικές αποστάσεις (COI: 12,3%, 16S rRNA: 6,4%, NaK: 2,9%). Υπό το φως αυτών των αποτελεσμάτων, κρίνεται απαραίτητη η αναθεώρηση της ταξινόμησης των ειδών Trachelipus που απαντώνται στην Ελλάδα. Τα αποτελέσματα της διατριβής μου προτείνουν την ύπαρξη δύο ενδεχομένων κρυπτικών ειδών αφενός για τους πληθυσμούς “T. palustris” που ομαδοποιούνται στον κλάδο της δυτικής ηπειρωτικής Ελλάδας και της βόρειας-βορειοδυτικής Πελοποννήσου και αφετέρου για του πληθυσμούς που ομαδοποιούνται στον κλάδο της βόρειας Εύβοιας και της χερσονήσου της Μαγνησίας Αντίθετα, με βάση τα αποτελέσματα της διατριβής προτείνω τη συγχώνευση των κρητικών πληθυσμών Τ. cavaticus και Τ. aegaeus σε ένα μόνο είδος (αυτό θα ήταν Τ. aegaeus δεδομένου ότι έχει προτεραιότητα). Τα φυλογενετικά δέντρα με την ισχυρή στατιστική υποστήριξη συμφωνούν με την παλαιογεωγραφική ιστορία της ελληνικής περιοχής από την εποχή του Μειόκαινου (23,03 εκ. χρόνια πριν). Οι γεωγραφικές κατανομές των ειδών φαίνεται να ακολουθούν την τεκτονική και κινηματική ανασυγκρότηση της περιοχής της ηπειρωτικής Ελλάδας, του Αιγαίου και της δυτικής Τουρκίας απεικονίζοντας τη σχέση μεταξύ των ορογενετικών διεργασιών, της ηπειρωτικής επέκτασης και της ανύψωσης των μεταμορφωμένων πετρωμάτων στις κινήσεις των τεκτονικών πλακών στην περιοχή. Τα αποτελέσματα της χρονολόγησης των κλάδων επιβεβαιώνουν τόσο τα γεωλογικά γεγονότα όσο και την ανασυγκρότηση του ελλαδικού χώρου που ευθύνονται για την σημερινή γεωγραφία και γεωλογία της περιοχής. Η Διατριβή μου αποτελεί την πρώτη ολοκληρωμένη μελέτη των φυλογενετικών σχέσεων σε πληθυσμούς χερσόβιων καρκινοειδών στην Ελλάδα. Τα αποτελέσματα κατέληξαν στην οριοθέτηση της γεωγραφικής εξάπλωσης των ειδών και την ανασύσταση των φυλογενετικών τους σχέσεων υπό το πρίσμα της παλαιογεωγραφικής ιστορίας και της σύγχρονης γεωγραφίας της νησιωτικής και ηπειρωτικής περιοχής. Τόσο οι φυλογενετικές σχέσεις όσο και οι γενετικές αποστάσεις μεταξύ των πληθυσμών φαίνεται να συνηγορούν στην περαιτέρω διερεύνηση της συστηματικής των ειδών του γένους. Η Διατριβή μου καταδεικνύει ότι η μορφολογία περιγράφει ανεπαρκώς την πραγματική ποικιλότητα μεταξύ των ειδών. Ως εκ τούτου, η ταξινόμηση των ειδών με βάση τους διαγνωστικούς χαρακτήρες και τα μορφολογικά χαρακτηριστικά που χρησιμοποιούνται μέχρι σήμερα για τα είδη Trachelipus θα πρέπει να επανεξεταστεί υπό το φως των νέων αυτών μοριακών φυλογενετικών αναλύσεων.