Μελέτη της επίδρασης της θυρεοειδοτρόπου ορμόνης και των θυρεοειδικών ορμονών στην in vitro ανάπτυξη πρώιμων πρωτογενών ωοθυλακίων επίμυος, στη γονιμοποίηση και στην πρώιμη εμβρυϊκή ανάπτυξη στο στάδιο της βλαστοκύστης και η ανίχνευση της έκφρασης των υποδοχέων τους στα διάφορα στάδια ωρίμανσης των ωοθυλακίων

Abstract

ΑΙΜThe aim of the study was to assess the effect of Thyrotropin (TSH) and thyroid hormones Triiodothyronine (T3) and Thyroxine (T4) in in vitro follicle growth of mouse primary preantral follicles, in in vitro fertilization and early embryo development to the blastocyst stage, and the expression of their receptors during follicle maturation. MATERIALS & METHODSPre-pubertal female mice, aged 13-14 days, and adult male mice, aged 3-4 months, all C57BL/6 x CBA F1 hybrids, were used in this animal experimental study. Primary preantral follicles were dissected from the ovaries, cultured in vitro for 10 days and mature oocytes were fertilized using sperm retrieved from adult male F1 hybrids. The effect of TSH in a concentration of 2 mIU/ml, 1 mIU/ml and 0.2 mIU/ml and the effect of T3 and in a concentration of 10-9 M, 10-8 M, 10-7 M each, were evaluated. Furthermore, on culture day 0, 2, 5 and 8, follicles were collected, and on culture day 10, cumulus oocyte complexes (COCs) and denuded oocytes (DO) were collected for total RNA extraction, which was used for complementary DNA synthesis. This in turn was subjected to Real-Time PCR for the detection and quantification of TSH receptor (TSHR) and thyroid hormone (TRα and TRβ) gene expression.RESULTSΤ3 was found to negatively affect follicular growth and maturation in the lower 10-9 M and intermediate 10-8 Μ concentrations. Similarly, Τ4 was found to negatively affect follicular growth and maturation of mouse preantral follicles in the intermediate concentration 10-8 Μ. Contrary to thyroid hormones, no impact of TSH was found in the process of folliculogenesis.Τ3 had a negative effect in fertilization and early embryo development to the 2-cell stage at a concentration of 10-8 M and T4 negatively affected fertilization at a concentration of 10-9 Μ and 10-7 Μ. Interestingly, higher 2-cell, 4-cell and morula/blastocyst stage rates were shown at a concentration of 10-8 Μ. TSH had no effect on fertilization and early embryo development.With regards to hormone receptor gene expression, on day 0, none of TSHR, TRα and TRβ were expressed. TRβ was not expressed at all throughout folliculogenesis (days 2, 5 and 8) and also was not expressed in COCs and DO. TRα and TRβ were expressed in follicles collected on days 2, 5 and 8 as well as in COCs, whereas their expression was absent in DO. CONCLUSIONSControversial results have been published regarding TSH, T3 and T4 effect on folliculogenesis in different species. But even within the same species, discrepancies have been observed among studies, which could be attributed to cell culture type, culture medium selection and supplementation, stage of development/differentation at follicle retrieval and duration of culture. The negative effect of T3 and the positive effect of T4 at the intermediate concentration 10-8 Μ in early embryo development, may encourage researchers to work on the effect of these hormones in various combinations during folliculogenesis, fertilization and early embryo development, that is, in conditions that mimic follicular physiology, given that in vivo these hormones co-exist in the follicular milieu.

ΣΚΟΠΟΣ. Ο σκοπός της μελέτης ήταν η αξιολόγηση της επίδρασης της Θυρεοειδοτρόπου ορμόνης (TSH) και των θυρεοειδικών ορμονών Τριιωδοθυρονίνη (T3) και Θυροξίνη (Τ4) στην in vitro ανάπτυξη πρώιμων πρωτογενών προκοιλοτικών ωοθυλακίων επίμυος, στη γονιμοποίηση και στην πρώιμη εμβρυϊκή ανάπτυξη στο στάδιο της βλαστοκύστης. Επιπλέον, σκοπός της μελέτης ήταν η ανίχνευση της έκφρασης των υποδοχέων των ανωτέρω ορμονών στα ωοθυλάκια κατά τα διάφορα στάδια της ωοθυλακικής ανάπτυξης. ΥΛΙΚΟ & ΜΕΘΟΔΟΣ. Στη μελέτη χρησιμοποιήθηκαν άνηβα θήλεα υβρίδια F1 ηλικίας 13-14 ημερών και ενήλικα άρρενα υβρίδια F1 ηλικίας 3-4 μηνών, προϊόντα διασταύρωσης επίμυων C57BL/6 (θήλυ) X CBA (άρρεν). Πρώιμα προκοιλοτικά ωοθυλάκια απομονώθηκαν από τις ωοθήκες, καλλιεργήθηκαν in vitro για 10 ημέρες και τα ώριμα ωάρια γονιμοποιήθηκαν με σπέρμα που ελήφθη από τα ενήλικα άρρενα υβρίδια. Αξιολογήθηκε η επίδραση της TSH σε συγκέντρωση 2 mIU/ml, 1 mIU/ml και 0,2 mIU/ml και η επίδραση των T3 και T4 σε συγκέντρωση 10-9 M, 10-8 M, 10-7 M η καθεμιά. Επιπλέον, τις ημέρες 0, 2, 5 και 8 της καλλιέργειας, συλλέχθηκαν ωοθυλάκια, ενώ την ημέρα 10 συμπλέγματα κοκκωδών κυττάρων-ωοκυττάρου (COCs) και απογυμνωμένα ωάρια (DO) προς απομόνωση ολικού RNΑ, από το οποίο συντέθηκε συμπληρωματικό DNA, το οποίο με τη σειρά του υπεβλήθη στην αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης πραγματικού χρόνου προς ανίχνευση και ποσοτικοποίηση της έκφρασης του υποδοχέα της TSH, TSHR, και των υποδοχέων των θυρεοειδικών ορμονών TRα και TRβ. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ. Η Τ3 είχε μία αρνητική επίδραση στην ωοθυλακική ανάπτυξη στην μικρότερη, 10-9 M, και ενδιάμεση συγκέντρωση, 10-8 Μ. Παρόμοια, η Τ4 είχε μία αρνητική επίδραση στην ωοθυλακική ανάπτυξη στην ενδιάμεση συγκέντρωση 10-8Μ. Σε αντίθεση με τις θυρεοειδικές ορμόνες, η TSH δεν είχε καμία επίδραση στην ωοθυλακιογένεση. Η Τ3 είχε μία αρνητική επίδραση στη γονιμοποίηση και την πρώιμη εμβρυική ανάπτυξη στο στάδιο των 2-κυττάρων στην ενδιάμεση συγκέντρωση 10-8 M και η T4 μία αρνητική επίδραση στη γονιμοποίηση στη μικρότερη και στη μεγαλύτερη συγκέντρωση, 10-9 Μ και 10-7 Μ αντίστοιχα. Ωστόσο, στην ενδιάμεση συγκέντρωση 10-8 Μ είχε μία θετική επίδραση, αφού οδήγησε σε μεγαλύτερα ποσοστά εμβρύων 2-κυττάρων, 4-κυττάρων και μοριδίου/βλαστοκύστης. Η TSH δεν είχε καμία επίδραση στη γονιμοποίηση και στην πρώιμη εμβρυική ανάπτυξη.Τέλος σε ότι αφορά την έκφραση των ορμονικών υποδοχέων, την ημέρα 0 δεν εκφραζόταν κανένας από τους TSHR, TRα και TRβ. Ο υποδοχέας TRβ, εξακολουθούσε να μην εκφράζεται σε όλα τα μετέπειτα στάδια της ωοθυλακιογένεσης, όπως και στα COCs και DO. Οι υποδοχείς ΤRα και TSHR εκφράζονταν στα ωοθυλάκια τις ημέρες 2, 5, 8 και στα COCs, ενώ δεν εκφράζονταν στα DO. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ. Στα διάφορα είδη ζώων υπάρχουν αντικρουόμενες αναφορές για την επίδραση της TSH και των T3 και T4 στην ωοθυλακιογένεση. Ωστόσο όμως, και στο ίδιο είδος, οι επιδράσεις φαίνεται ότι διαφοροποιούνται ανάλογα με τον τύπο των κυττάρων που καλλιεργούνται, το είδος και τον εμπλουτισμό του καλλιεργητικού μέσου, το στάδιο ανάπτυξης των ωοθυλακίων, και τη χρονική διάρκεια της καλλιέργειας.Η διαπίστωση της αρνητικής επίδρασης της Τ3 και της θετικής επίδρασης της ενδιάμεσης συγκέντρωσης 10-8 Μ της Τ4 στην πρώιμη εμβρυική ανάπτυξη, ανοίγει νέους δρόμους έρευνας της επίδρασης ορμονών αυτών σε διάφορους συνδυασμούς μεταξύ τους, σε συνθήκες που προσομοιάζουν την φυσιολογία της ωοθυλακικής ανάπτυξης, με δεδομένο ότι οι ορμόνες αυτές in vivo συνυπάρχουν στο μικροπεριβάλλον των ωοθυλακίων.