Διαφορική έκφραση πρωτεϊνών σε παγκρεατικά β κύτταρα υπό την επίδραση της γλυκόζης

Abstract

Chronic hyperglycemia is involved in the pathogenesis of diabetes. Chronic exposure of beta cells to high glucose concentration leads to toxic effects, a situation named "glucose toxicity". There are several studies relating glucose toxicity to oxidative stress, defect insulin secretion, decreased insulin gene expression and beta cell apoptosis. Although there are several studies on glucose toxicity, the molecular aspects of the phenomenon are not totally understood. Recently, proteomic analysis has provided important information about proteins involved in the pathogenesis of diabetes. The aim of the present thesis is the study of differentially expressed proteins in the pancreatic beta cells under high glucose conditions. Thereafter, our studies focused on ERp46, an endoplasmic reticulum component, and analyze its involvement in glucose toxicity and in insulin production/secretion. Initially, the influence of high glucose was studied by proteomic analysis. Proteomic analysis led to identification of 46 differentially expressed spots, corresponding to 23 proteins having a broad range of functions and mainly classified as catalytic and chaperone proteins. Among the 23 differentially expressed proteins, under high glucose conditions, ERp46 was selected as a very interested protein which hasn’t been extensively studied so far and sufficiently correlated with glucose toxicity. Since ERp46 is a novel protein with a possible crucial role in secretory cells, its role further analyzed in beta cell function. Proteomic analysis revealed that ERp46 is decreased under high glucose conditions relatively to cultured beta cells under low glucose conditions and these results were further confirmed with immunoblotting analysis, while the post-translation modifications of ERp46 remain unchanged under the influence of glucose. The studies were continued in isolated mouse pancreatic islets where the expression of ERp46 was reduced in high glucose conditions. Further analysis revealed high expression of ERp46 in pancreatic islets compared to exocrine tissue, which is a very interesting result, as the high expression of ERp46 in the endocrine pancreas is probably related to a specific function. Interestingly, a marked decrease in ERp46 expression was found in the pancreatic islets of diabetic mice db/db, indicating the involvement of ERp46 in glucose toxicity, which further Abstract 180 confirmed our results and indicated that the reduction of ERp46 expression is probably part of diabetic conditions. Taking into account the results of the present study that ERp46 is reduced under high glucose conditions, the fact that ERp46 is implicated in disulfide bond formation, chronic exposure to elevated glucose concentrations reduce insulin production and that insulin has disulfide bonds, we can assume that the reduction of ERp46 expression in pancreatic beta cells in high glucose conditions is probably related to high glucose-induced insulin reduction. This hypothesis was further studied, and siRNA-mediated knockdown of ERp46 in cultured beta cells led to a significant decrease in the insulin content; however no alterations in insulin mRNA levels were observed, while the expression level of two other proteins having disulfide bonds, PDI and Calreticulin, did not change under these conditions. In addition, the inhibition of ERp46 expression by siRNA, increase the expression of CHOP and peIF2a, indicating the development of ER stress. In conclusion, proteomic analysis revealed several proteins involved in glucose toxicity, and further studies implicated ERp46 as an important component in insulin production at the post-translational level, suggesting ERp46 as a potential crucial molecule of diabetic conditions

Η χρόνια υπεργλυκαιμία εμπλέκεται σημαντικά στην παθογένεια του διαβήτη και η έκθεση των βήτα κυττάρων στις υψηλές συγκεντρώσεις γλυκόζης οδηγεί σε τοξικά αποτελέσματα που αναφέρονται ως "τοξικότητα γλυκόζης". Υπάρχουν πολλές μελέτες που σχετίζουν την τοξικότητα της γλυκόζης με το οξειδωτικο stress, την ελαττωματική έκκριση ινσουλίνης, την μειωμένη έκφραση γονιδίων ινσουλίνης και την απόπτωση των βήτα κυττάρων. Παρά τις μελέτες που υπάρχουν για την τοξικότητα της γλυκόζης, το φαινόμενο δεν είναι πλήρως κατανοητό και πρόσφατα η πρωτεομική ανάλυση προσέφερε σημαντικές πληροφορίες για πρωτεΐνες που εμπλέκονται στην παθογένεια του διαβήτη. Σκοπός της παρούσας διατριβής είναι να μελετηθεί η διαφορική έκφραση πρωτεϊνών σε παγκρεατικά βήτα κύτταρα υπό την επίδραση υψηλής γλυκόζης. Στη συνέχεια, η μελέτη εστιάστηκε στην ERp46, μια πρωτεΐνη του ενδοπλασματικού δικτύου, αναλύοντας τη συμμετοχή της στην τοξικότητα της γλυκόζης και στη βιοσύνθεση της ινσουλίνης. Αρχικά μελετήθηκε η επίδραση της υψηλής γλυκόζης στα παγκρεατικά βTC-6 κύτταρα μέσω της πρωτεομικής ανάλυσης. Η πρωτεομική ανάλυση οδήγησε στον προσδιορισμό 46 διαφορικά εκφραζόμενων πρωτεϊνικών κηλίδων, που αντιστοιχούν σε 23 πρωτεΐνες οι οποίες έχουν μια ευρεία σειρά λειτουργιών και ταξινομήθηκαν κυρίως ως καταλυτικές και συνοδοί πρωτεΐνες. Ανάμεσα στις 23 πρωτεΐνες που προσδιορίστηκαν με διαφορική έκφραση, σε συνθήκες υψηλής γλυκόζης, ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζει η ERp46, η οποία δεν έχει μελετηθεί ως τώρα εκτενώς και δεν έχει συσχετιστεί επαρκώς με την τοξικότητα της γλυκόζης. 1εδομένου ότι η ERp46 είναι μια νέα πρωτεΐνη με έναν πιθανά κρίσιμο ρόλο στα εκκριτικά κύτταρα, μελετήθηκε περαιτέρω ο ρόλος της στη λειτουργία των β κυττάρων. Η πρωτεομική ανάλυση έδειξε ότι η ERp46 μειώνεται υπό την επίδραση υψηλής γλυκόζης συγκριτικά με κύτταρα που καλλιεργήθηκαν σε χαμηλή γλυκόζη και τα αποτελέσματα αυτά επιβεβαιώθηκαν περαιτέρω με την τεχνική της ανοσοαποτύπωσης, ενώ οι μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις που υφίσταται δεν μεταβάλλονται με την επίδραση της γλυκόζης. Οι μελέτες συνεχίστηκαν σε απομονωμένα παγκρεατικά νησίδια μυών όπου η έκφραση της ERp46 βρέθηκε να Περίληψη 178 μειώνεται στην υψηλή συγκέντρωση γλυκόζης. Περαιτέρω ανάλυση αποκάλυψε την υψηλή έκφραση της ERp46 στα παγκρεατικά νησίδια συγκριτικά με την εξωκρινή μοίρα του παγκρεατικού ιστού και αυτό αποτελεί ένα ιδιαίτερα ενδιαφέρον αποτέλεσμα, καθώς η έντονη παρουσία της ERp46 στο ενδοκρινές τμήμα του παγκρέατος πιθανά να σχετίζεται με μια συγκεκριμένη λειτουργία. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον προκαλεί και η χαρακτηριστική μείωση που παρατηρήθηκε στην έκφραση της ERp46 στα παγκρεατικά νησίδια διαβητικών μυών db/db, δείχνοντας τη συμμετοχή της ERp46 στην τοξικότητα της γλυκόζης, επιβεβαιώνοντας περαιτέρω τα αποτελέσματα μας και καταδεικνύοντας ότι η μείωση της έκφρασης της ERp46 μπορεί να αποτελεί μέρος των διαβητικών καταστάσεων. Αν λάβουμε υπόψη τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης ότι η ERp46 μειώνεται υπό την επίδραση υψηλής γλυκόζης, ότι εμπλέκεται στο σχηματισμό δισουλφιδικών δεσμών, ότι η χρόνια έκθεση σε υψηλή γλυκόζη μειώνει τα επίπεδα της ινσουλίνης και ότι η ινσουλίνη διαθέτει δισουλφιδικούς δεσμούς, μπορούμε να υποθέσουμε ότι η μείωση της έκφρασης της ERp46 στα παγκρεατικά β κύτταρα σε συνθήκες υψηλής γλυκόζης πιθανά να σχετίζεται με τη μείωση της ινσουλίνης που προκαλείται από την υψηλή γλυκόζη. Αυτή η υπόθεση μελετήθηκε σε πειράματα καταστολής της έκφρασης της ERp46 μέσω siRNA σε καλλιεργημένα β TC-6 κύτταρα όπου παρατηρήθηκε μια σημαντική μείωση στην έκκριση και στην περιεκτικότητα της ινσουλίνης χωρίς όμως να παρατηρηθεί καμία αλλαγή στα επίπεδα του mRNA της ινσουλίνης. Ανάλογη μελέτη πραγματοποιήθηκε και σε δύο άλλες πρωτεΐνες που διαθέτουν δισουλφιδικούς δεσμούς, η PDI και η καλρετικουλίνη, στις οποίες δεν παρατηρήθηκε καμία διαφορά υπό αυτές τις συνθήκες. Επιπλέον, η καταστολή της έκφρασης της ERp46, που προκλήθηκε μέσω siRNA, αύξησε την έκφραση των πρωτεϊνών Chop και peIF2a, μόρια που ενοχοποιούνται για την ανάπτυξη του stress του ενδοπλασματικού δικτύου. Συμπερασματικά καταλήγουμε ότι η πρωτεομική ανάλυση ανέδειξε μια σειρά από πρωτεΐνες που ενοχοποιούνται στην τοξικότητα της γλυκόζης ενώ περαιτέρω μελέτη ανέδειξε την πρωτεΐνη ERp46 ως ένα σημαντικό συστατικό καθώς εμπλέκεται στη βιοσύνθεση της ινσουλίνης σε επίπεδο μετα-μεταφραστικό, προτείνοντας την ως ένα υποθετικό κρίσιμο μόριο των διαβητικών καταστάσεων