Οι ρυθμιστές της αδειοδότησης της αντιγραφής Geminin, McIdas και GemC1 στη γονιδιωματική σταθερότητα και στη διαφοροποίηση των πολυκροσσωτών κυττάρων

Abstract

To maintain genome integrity cells must ensure that chromosomes are fully replicated and sister chromatids are segregated accurately to the daughter cells in each cell cycle. The chromosome and centrosome cycles in proliferating cells must be coordinated to ensure that genome and centriole duplication occur only once per cell cycle. Common regulators have been identified, but their role in linking the two cycles awaits elucidation. Geminin family members are implicated both in cell cycle and differentiation control and are likely to constitute common key regulators of genome and centrosome duplication. Geminin, the founding member of the family, was initially characterized as a negative regulator of the initiation of DNA replication in metazoa. Geminin is a coiled-coil protein that interacts and inactivates the licensing factor Cdt1, preventing the re-firing of origins until the beginning of the next cell cycle. Geminin also acts as a negative regulator of the centriole cycle, safeguarding genome stability. Geminin has also been linked to cell fate decisions, through binding to transcription factors and chromatin remodelling complexes, thereby controlling transcription of specific target genes. Recently, the vertebrate-specific GemC1 and McIdas were identified due to the significant conservation of their coiled-coils to the coiled-coil domain of Geminin. McIdas binds to Geminin and inhibits its association with Cdt1. GemC1 mediates the formation of the pre-initiation complex during DNA replication.In previous studies from our lab it has been shown that similar to Geminin, GemC1 and McIdas are implicated in differentiation decisions. In this study, we aim to understand their roles during multiciliate cell differentiation. Multiciliated cells are terminally differentiating cells, which massively amplify their centrioles, bypassing the rule for the once-per-cell-cycle centriole duplication. Hundreds of centrioles dock to the apical cell surface and generate motile cilia, whose concerted movement ensures fluid flow across epithelia. In ciliated epithelia GemC1 and McIdas are expressed at high levels during development. Their expression closely mirrors Foxj1 expression, a transcription factor specifically expressed in cells with motile cilia and implicated in multiciliogenesis. An ex vivo ciliogenesis model using mouse tracheal epithelial cells was used to assess the timing of GemC1 and McIdas expression during multiciliogenesis. Their expression is increased directly after the induction of multiciliate cell differentiation, dropping when ciliogenesis is completed. Their levels of expression are increased when multiple centriole formation is taking place. On the contrary, Geminin shows an inverted expression pattern, with high levels in cycling progenitor cells. Its expression diminishes as cells progress towards differentiation. In more detail, McIdas protein is expressed in early differentiating cells and its expression is lost as multiciliated cells mature. The ectopic expression of McIdas and GemC1 can promote the early steps of multiciliogenesis. The same phenotype was observed after the depletion of Geminin, suggesting its antagonistic role. GemC1 and McIdas activate transcriptionally the upstream regulatory elements of FOXJ1 gene. Their transcriptional activity is enhanced by the transcription factor E2F5 and inhibited by Geminin. GemC1 is able to induce transcription from the MCIDAS gene, while the opposite is not possible. Also, McIdas is able to transactivate its own promoter, creating a positive feedback loop that locks commitment toward multiciliogenesis. The in vivo role of GemC1 during multiciliate cell differentiation was delineated after the depletion of GemC1 from mice. Mice lacking GemC1 are born with airway epithelia devoid of multiciliated cells and die soon after birth. Finally, we studied the role of McIdas protein in centriole duplication, in dividing cells. McIdas is specifically localized in the distal part of the mother centriole. Overexpression of the McIdas protein affects centriole numbers in cycling cells, suggesting a possible role of McIdas during the centrosome cycle. The above data suggest that Geminin family members are central regulators of centriole duplication and multiciliate cell differentiation. Intricate positive and negative regulatory interactions among them appear important for their function. Geminin, GemC1 and McIdas may link DNA replication to centriole duplication and multiciliogenesis, acting close to the transition from proliferation to differentiation.

Η γονιδιωματική σταθερότητα στα κύτταρα απαιτεί την πλήρη αντιγραφή του γονιδιώματος και τον ακριβοδίκαιο διαχωρισμό των διπλασιασμένων χρωμοσωμάτων στα θυγατρικά κύτταρα σε κάθε κυτταρική διαίρεση. Αυτό επιτυγχάνεται μέσω της συντονισμένης λειτουργίας των κύκλων διπλασιασμού και διαχωρισμού των χρωμοσωμάτων και των κεντροσωματίων. Τα τελευταία χρόνια, ένας αυξανόμενος αριθμός μορίων έχει χαρακτηριστεί να συμμετέχει και στους δύο κύκλους. Ωστόσο, ο τρόπος με τον οποίο δρουν για το συντονισμό τους παραμένει άγνωστος. Στην παρούσα διατριβή εξετάστηκαν τα μέλη της υπεροικογένειας της Geminin στον κυτταρικό κύκλο και στην κυτταρική διαφοροποίηση. Τα ευρήματα καθιστούν τις πρωτεΐνες Geminin, McIdas και GemC1 πιθανoύς κοινούς ρυθμιστές της αντιγραφής του DNA και του διπλασιασμού των κεντριολίων. Η πρωτεΐνη Geminin είναι το πρώτο μέλος της οικογένειας που χαρακτηρίστηκε στα μετάζωα και έχει μελετηθεί εκτενώς για το ρόλο της στον κυτταρικό κύκλο. Συνεισφέρει σημαντικά στη διατήρηση της γονιδωματικής σταθερότητας. Μέσω μιας περιοχής σπειροειδούς σπειράματος που διαθέτει αλληλεπιδρά με τον παράγοντα αδειοδότησης της αντιγραφής Cdt1, αναστέλλοντας την πρόωρη πυροδότηση των αφετηριών της αντιγραφής. Ακόμα, δρα ανασταλτικά στον υπερδιπλασιασμό των κεντροσωματίων. Τέλος, συμμετέχει και σε αποφάσεις κυτταρικής διαφοροποίησης. Αλληλεπιδρά με μεταγραφικούς παράγοντες και σύμπλοκα αναδιάταξης της χρωματίνης, ελέγχοντας τη γονιδιακή έκφραση. Τα τελευταία χρόνια ταυτοποιήθηκαν στα σπονδυλωτά τα δυο νέα μέλη της οικογένειας, GemC1 και McIdas, βάση της ομοιότητας που παρουσίαζαν με τη Geminin στην περιοχή του σπειροειδούς σπειράματος που διαθέτουν. Η πρωτεΐνη McIdas αλληλεπιδρά με τη Geminin και εμποδίζει την πρόσδεσή της στον παράγοντα Cdt1, ενώ ο παράγοντας GemC1 συμβάλλει στο σχηματισμό του προεναρκτήριου συμπλόκου της αντιγραφής. Αρχικά πειράματα στο εργαστήριό μας έδειξαν ότι οι παράγοντες GemC1 και McIdas είναι πιθανό να εμπλέκονται, όπως και η Geminin, σε διαδικασίες κυτταρικής διαφοροποίησης. Στην παρούσα διατριβή μελετήσαμε το ρόλο τους κατά τη διαφοροποίηση των πολυκροσσωτών κυττάρων. Τα πολυκροσσωτά κύτταρα είναι τελικώς διαφοροποιημένα κύτταρα, στα οποία παράγεται ένας μεγάλος αριθμός κεντριολίων που δρουν ως βασικά σωμάτια για το σχηματισμό πολλαπλών κροσσών. Αρχικά, δείχθηκε ότι οι παράγοντες GemC1 και McIdas εκφράζονται σε υψηλά επίπεδα κατά την ανάπτυξη των μυών σε ιστούς όπου απαντώνται πολυκροσσωτά κύτταρα. Η έκφρασή τους συμπίπτει με αυτή του παράγοντα Foxj1, που αποτελεί ένα σημαντικό ρυθμιστή της μετανάστευσης των νεοσυντιθέμενων κεντριολίων στην πλασματική μεμβράνη και της δημιουργίας του αξονήματος των κροσσών. Η έκφρασή τους μελετήθηκε πιο ειδικά στα στάδια της διαφοροποίησης, σε ένα ex vivo σύστημα καλλιέργειας επιθηλιακών κυττάρων τραχείας μυών. Οι GemC1 και McIdas εκφράζονται αμέσως μετά την επαγωγή της διαφοροποίησης και μειώνονται με την ολοκλήρωση της διαδικασίας. Τα υψηλότερα επίπεδα της έκφρασής τους ανιχνεύονται στο στάδιο του πολλαπλασιασμού των κεντριολίων. Αντίθετα, η Geminin εμφανίζει ένα ανεστραμμένο πρότυπο έκφρασης, με υψηλότερα επίπεδα στα διαιρούμενα προγονικά κύτταρα. Περαιτέρω μελέτη έδειξε ότι η πρωτεΐνη McIdas εκφράζεται ειδικά στα πρώιμα στάδια της διαφοροποίησης, ενώ η έκφρασή της εξαφανίζεται στα ώριμα πολυκροσσωτά κύτταρα. Για το χαρακτηρισμό της λειτουργίας των μελών της υπεροικογένειας της Geminin κατά την εξειδίκευση των πολυκροσσωτών κυττάρων πραγματοποιήθηκαν πειράματα υπερέκφρασης και αποσιώπησης. Υπερέκφραση των GemC1 και McIdas έδειξε ότι είναι ικανοί να επάγουν τα πρώιμα στάδια διαφοροποίησης. Ο ίδιος φαινότυπος παρατηρήθηκε μετά την αποσιώπηση της Geminin, ενισχύοντας την υπόθεση για ανταγωνιστική δράση των μελών της υπεροικογένειας. Οι παράγοντες GemC1 και McIdas προκαλούν τη μεταγραφική ενεργοποίηση του Foxj1. Επιπλέον, ο παράγοντας GemC1 επάγει τη μεταγραφή του McIdas, ενώ το αντίθετο δεν παρατηρήθηκε. Η λειτουργία τους αυτή ενισχύεται μέσω συνεργασίας με το μεταγραφικό παράγοντα E2F5, ενώ η Geminin αναστέλλει τη μεταγραφική ενεργότητα των GemC1 και McIdas. Τέλος, ο McIdas δρα μέσω ενός μηχανισμού θετικής ανατροφοδότησης, καθώς είναι ικανός να επάγει τη μεταγραφή από τα ρυθμιστικά στοιχεία του γονιδίου του. Τα παραπάνω πειράματα συνέβαλαν στο να αποσαφηνιστεί ο μοριακός μηχανισμός μέσω του οποίου τα μέλη της υπεροικογένειας της Geminin ελέγχoυν το μονοπάτι της διαφοροποίησης. Η κατασκευή διαγονιδιακών μυών ανέδειξε τον in vivo ρόλο του παράγοντα GemC1. Οι ελλειμματικοί για το γονίδιο GemC1 μύες εμφανίζουν καθυστέρηση στην ανάπτυξη και πεθαίνουν σύντομα μετά τη γέννα. Επίσης, αναδείχθηκε ο καθοριστικός ρόλος του στη διαφοροποίηση των πολυκροσσωτών κυττάρων, αφού αυτά απουσιάζουν εντελώς από την τραχεία των διαγονιδιακών μυών. Τέλος, μελετήθηκε η συμμετοχή της πρωτεΐνης McIdas στον πολλαπλασιασμό των κεντριολίων στα διαιρούμενα κύτταρα. Η πρωτεΐνη McIdas εκφράζεται ειδικά στο μητρικό κεντριόλιο των κεντροσωματίων και προκαταρκτικά πειράματα υπερέκφρασής της προκάλεσαν αύξηση στον αριθμό των κεντριολίων, υποδηλώνοντας την εμπλοκή της στο διπλασιασμό τους. Τα παραπάνω δεδομένα μαρτυρούν ότι τα μέλη της υπεροικογένειας της Geminin αποτελούν κεντρικούς ρυθμιστές του πολλαπλασιασμού των κεντριολίων και της διαφοροποίησης των πολυκροσσωτών κυττάρων. Μέσω θετικών ή αρνητικών αλληλεπιδράσεων που αναπτύσσουν, τόσο μεταξύ τους όσο και με άλλους παράγοντες είναι πιθανό να συνδέουν την αντιγραφή του DNA με τον πολλαπλασιασμό των κεντριολίων και τη δημιουργία των πολυκροσσωτών κυττάρων.