Εκτίμηση της λειτουργικής ικανότητας των ειδικών για τον HIV CD4 και CD8 λεμφοκυττάρων στη διάρκεια της λοίμωξης προ και κατά τη διάρκεια της θεραπείας (HAART)

Abstract

Purpose: The purpose of this study is the qualitative and quantitative evaluation of thespecific immune response in HIV+ patients. The functional capacity of HIV specificCD4+ and CD8+ T lymphocytes in HIV infection and their role in therapy wasassessed via the use of tetramers and intracellular cytokines detection by flowcytometric analysis.Patients: Samples from 94 HIV+ patients admitted to the Special Infections Unit ofEvangelismos hospital were taken; 61 patients were HLA-A2 positive. Thirty twocontrol samples were included, 10 of which were HLA-A2 positive.Materials and Methods: In order to identify specific cytotoxic CD8+ T lymphocytesand their sub-populations, whole blood in EDTA was incubated with tetramers i.e.complexes of four MHC molecules bound to an antigenic peptide and a fluorescentdye allowing the direct evaluation of the specific CD8+ T lymphocyte population.Tetramer complexes of MHC-1 bound to HIV antigens (HLA-A 0201 HIV pol, HLAA0201 HIV gag) or CMV peptides (HLA-A 0201 CMV pp65), were used. CMVtetramers were used to monitor persistence of the anamnestic immunologic response,while the HIV tetramers served to evaluate immunologic responses to HIV.Additionally, the number of total HIV- and CMV- CD8+ T lymphocytes and theirsubpopulations, and, in particular, the CD8+/CD27+ T cells as well as their subtypes,i.e. CD45RA+ (naïve) and CD45RO+ (memory) T cells, were also studied.In order to isolate HIV- specific CD4+ and CD8+ T lymphocyte populations viaintracellular cytokine detection, whole blood (in heparin) was stimulated with HIVand CMV peptides along with staphylococcal enterotoxin B (SEB) superantigen as apositive control. CD28 and CD49d antigens were used for co-stimulation. The cellswere subjected to a 6-hour incubation, followed by a staining procedure to locateintracellular cytokines and, finally, to flow cytometry analysis to evaluate the numberof CD4+CD69+IL-2+ and CD4+CD69+IFN-γ+ cells as well as the CD4-CD69+IL-2+and CD4-CD69+IFN-γ+ cells in the total CD3+ population of T cells.Results: The percentage of patients with CMV- specific CD8+ T lymphocytes, amarker for monitoring the persistence of immunologic memory, was almost double(79.6%) that of patients with HIV- specific CD8+ T lymphocytes (pol 39,3% and gag37,5%). HIV- specific CD8+ T lymphocytes, positive for pol and gag, consisted ofseveral subpopulations, with a surplus of CD27+ cells recognizing gag, irrespective oftheir CD45RA or CD45RO expression. Moreover, the persistence of the CD27+population correlated with increased morbidity and disease progression in HIVinfection.HIV+ patients retained the capability of producing Il-2 and IFNγ following SEBsuperantigen stimulation of total CD4+ T cells (94.3%) and CD8+ T cells (91.4).However, the number of HIV+ patients able to synthesize Il-2 and IFNγ in response toCMV was comparatively lower (CD4+ T: 72,2% and CD8+ T: 68,6%), while evenfewer patients were able to respond to HIV (CD4+ T: 58,8% and CD8+ T: 57,6%).Detection of the Il-2 and IFNγ cytokine combination produced by CD8+CD69+ Tcells in response to staphylococcal enterotoxin B (SEB) stimulation, was morefrequent in patients undergoing therapy than those not in therapy. Furthermore, thecombined synthesis of Il-2 and IFNγ by CD8+CD69+ T cells following HIV peptidestimulation was significantly increased in patients under therapy as compared to thosewho had not received any.Conclusion: The detection of HIV-specific CD8+ T lymphocytes via the use oftetramers as well as the isolation of HIV- specific CD4+ and CD8+ T cells viaintracellular cytokine staining and flow ctometry analysis, offer significantinformation concerning assessment of the specific imuunologic response against HIV.The increased amount of HIV-specific CD27+ CD8+ T lymphocytes may suggest thatthey do not mature sufficiently to be able to inhibit viral proliferation, as they fail todifferentiate into fully mature, active cells. Since surface antigens are only indicativeand not precisely characteristic of the exact stage of differentiation or the functionalcapacity of the cell, more studies are needed to further define their particular role. Itwas also determined that anti-retroviral treatment improves the activity of HIVspecificCD8+ T lymphocytes as regards their ability to synthesize cytokines, which isa sign of a revitalized immune system in patients under therapy.

Σκοπός: Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν η ποσοτική και ποιοτική εκτίμηση της ειδικής ανοσολογικής απάντησης σε HIV+ ασθενείς. Χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος της κυτταρομετρίας ροής (τετραμερή, ενδοκυττάρια ανίχνευση κυτταροκινών) με σκοπό την εκτίμηση της λειτουργικής ικανότητας των ειδικών για τον HIV CD4+ και CD8+ Τ λεμφοκυττάρων στη διάρκεια της HIV λοίμωξης και σε σχέση με τη θεραπεία.Ασθενείς: Μελετήθηκαν 94 δείγματα HIV(+) ασθενών που παρακολουθούνται στη Μονάδα Ειδικών Λοιμώξεων του ΓΝΑ «Ευαγγελισμός» (61 ασθενείς ήταν θετικοί για το HLA-A2). Επιπλέον, μελετήθηκαν 32 μάρτυρες (Οι 10 ήταν θετικοί για το HLA-A2).Μέθοδοι: Για τον προσδιορισμό των ειδικών κυτταροτοξικών CD8+ Tλεμφοκυττάρων και των υποπληθυσμών τους ακολουθήθηκε η εξής μεθοδολογία:Έγινε χρώση πλήρους αίματος (σε EDTA) με τετραμερή, δηλ. διαλυτά συμπλέγματα από τέσσερα MHC μόρια συνδεδεμένα με αντιγονικό πεπτίδιο και φθορίζουσα ουσία που επιτρέπει την άμεση μέτρηση των ειδικών CD8+ T λεμφοκυττάρων.Χρησιμοποιήθηκαν τετραμερή σύμπλοκα MHC-Ι με πεπτίδια του HIV( HLA-A 0201HIV pol, HLA-A 0201 HIV gag) και του CMV (HLA-A 0201 CMV pp65). Τατετραμερή του CMV χρησιμοποιήθηκαν για τον έλεγχο της διατήρησης ανοσιακής απάντησης σε αναμνηστικά αντιγόνα και τα τετραμερή του HIV χρησιμοποιήθηκαν για τον έλεγχο της ανοσιακής απάντησης στον HIV. Παράλληλα μελετήθηκαν οι υποπληθυσμοί των ειδικών για τον HIV και τον CMV CD8+ T λεμφοκυττάρων και του συνόλου τους και συγκεκριμένα τα CD8+/CD27+T-λεμφοκύτταρα καθώς και οι υποομάδες αυτών όσον αφορά τα CD45RA+ (παρθένα) και CD45RO+( μνημονικά)Τ-λεμφοκύτταρα. Για την ανίχνευση ειδικών για τον HIV CD4+ και CD8+ T λεμφοκυττάρων με ενδοκυττάρια ανίχνευση κυτταροκινών έγινε διέγερση πλήρους αίματος (σε ηπαρίνη)με πεπτίδια HIV, CMV και το υπεραντιγόνο σταφυλοκοκκική εντεροτοξίνη Β (SEB)ως θετικός μάρτυρας. Για συνδιέγερση χρησιμοποιήθηκαν αντισώματα CD28 καιCD49d. Μετά επώαση έξι ωρών ακολούθησε η τεχνική χρώσης των ενδοκυττάριων κυτταροκινών και η μέτρηση στον κυτταρομετρητή ροής των CD4+CD69+IL-2+ και των CD4+CD69+IFN-γ+ κυττάρων, όπως και των CD4-CD69+IL-2+ και των CD4-CD69+IFN-γ+ κυττάρων, στο σύνολο των CD3+ T κυττάρων. Το CD69 χρησιμοποιήθηκε ως πρώιμος δείκτης ενεργοποίησης. Αποτελέσματα: Διαπιστώθηκε ότι τα ποσοστά των ασθενών με CMV-ειδικάCD8+ T λεμφοκύτταρα, που χρησιμοποιήθηκαν για τον έλεγχο διατήρησης της ανοσιακής απάντησης σε αναμνηστικά αντιγόνα, ήταν σχεδόν διπλάσια (79,6%) από τα αντίστοιχα ποσοστά των ασθενών με HIV ειδικά CD8+ T λεμφοκύτταρα (pol39,3% και gag 37,5%). Τα HIV- ειδικά CD8+ T λεμφοκύτταρα, θετικά για τα πεπτίδια pol και gag, αποτελούνταν από ποικιλία υποπληθυσμών με υπεροχή τωνCD27+ κυττάρων όσον αφορά στο πεπτίδιο gag, ανεξάρτητα από την έκφραση τωνCD45RA ή CD45RO. Αντίθετα, στα CMV-ειδικά CD8+ T λεμφοκύτταρα, υπερείχαν σαφώς τα CD27(-) κύτταρα, ανεξάρτητα από την έκφραση των CD45RA ή CD45RO.Επιπρόσθετα, η διατήρηση του πληθυσμού των CD27+ κυττάρων συσχετιζόταν με επιδείνωση των δεικτών παρακολούθησης της HIV λοίμωξης.Στους HIV+ ασθενείς η ικανότητα παραγωγής των κυτταροκινών IL-2 καιIFNγ, διατηρείτο μετά από διέγερση με το υπεραντιγόνο SEB που αφορούσε τοσύνολο των CD4+ T λεμφοκυττάρων (94,3%) και των CD8+ T λεμφοκυττάρων(91,4%). Όμως η ικανότητα παραγωγής των κυτταροκινών IL-2 και IFNγ έναντι τουCMV διατηρείτο σε μικρότερο συγκριτικά αριθμό HIV+ ασθενών (CD4+ T:72,2%και CD8+ T:68,6%) και σε ακόμη μικρότερο αριθμό ασθενών διατηρείτο η απάντηση έναντι του HIV(CD4+ T:58,8% και CD8+ T: 57,6%). Η ανίχνευση του συνδιασμούτων κυτταροκινών IL-2 και IFNγ που παράγονται από τα CD8+CD69+Tλεμφοκύτταρα, μετά από διέγερση με σταφυλοκοκκική εντεροτοξίνη Β (SEB) στους ασθενείς που βρίσκονταν υπό θεραπεία ήταν συχνότερη σε σχέση με εκείνους τους ασθενείς που δεν βρίσκονταν υπό αγωγή. Επιπλέον, η συνδιασμένη παραγωγή IL-2 και IFNγ από τα CD8+CD69+T λεμφοκύτταρα μετά από διέγερση με πεπτίδια HIVήταν σημαντικά αυξημένη σε ασθενείς υπό θεραπεία σε σχέση με τους ασθενείς που δεν είχαν λάβει θεραπεία Διαπιστώθηκε, δηλ. ότι η ικανότητα παραγωγής των κυτταροκινών IL-2 και IFNγ στο σύνολο των CD8+ T λεμφοκυττάρων μετά διέγερση με SEB, αλλά και με πεπτίδια HIV, ήταν μεγαλύτερη στους ασθενείς υπό αγωγή.Συμπεράσματα: Η ανίχνευση ειδικών για τον HIV CD8+ T λεμφοκυττάρων με χρήση τετραμερών και η ανίχνευση ειδικών για τον HIV CD4+ και CD8+ Tλεμφοκυττάρων με ενδοκυττάρια ανίχνευση κυτταροκινών, με κυτταρομετρία ροής,είναι μέθοδοι που παρέχουν σημαντικές πληροφορίες για την εκτίμηση της ειδικής ανοσιακής απάντησης έναντι του HIV. Η υπεροχή των CD27+HIV-ειδικών CD8+ Tλεμφοκυττάρων, μπορεί να σημαίνει ότι δεν ωριμάζουν επαρκώς και δεν είναι ικανά να αναστείλουν τον ιικό πολλαπλασιασμό, διότι αποτυγχάνουν να διαφοροποιηθούν σε πλήρως ώριμα δραστικά κύτταρα. Επειδή οι δείκτες επιφανείας είναι ενδεικτικοί και δεν μπορούν να προβλέψουν με ακρίβεια το βαθμό διαφοροποίησης και τη λειτουργική ικανότητα των κυττάρων, περαιτέρω μελέτες θα προσδιορίσουν τον ακριβή ρόλο τους. Τέλος, βρέθηκε ότι η αντιρετροϊκή θεραπεία βελτιώνει τη λειτουργικότητα των HIV-ειδικών CD8+ T λεμφοκυττάρων, όσον αφορά την ικανότητα παραγωγής κυτταροκινών από αυτά, δηλ. διαπιστώθηκε η τάση ανάκαμψης του ανοσιακού συστήματος των ασθενών υπό θεραπεία.