Ανάπτυξη νανοανιχνευτών για τη στοχευμένη μοριακή ανίχνευση και απεικόνιση των μικρομεταστάσεων

Abstract

Aim-BackgroundTo evaluate the incorporation of cadmium selenide quantum dots (QDs) in the detection of colorectal cancer (CRC) circulatingtumour cell (CTC) surface antigens.Material and MethodsThe principle of this assay is based upon the separation of CTCs from body fluids using magnetic beads (MBs) coupled withspecific antibody biomarkers, such as the Epithelial cell Adhesion Molecule Antibody (EpCAM) and Cytokeratin 19 (CK19)antibody. The detection signal was acquired from the fluorescence signal of QDs. To evaluate the performance, the methodunder study was used to isolate the human colon adenocarcinoma cell line (DLD- and CTCs from CRC patients’ peripheralblood samples. Peripheral blood samples were obtained from 9 CRC patients and 5 healthy donors who gave their informedconsent to their inclusion in the study. Peripheral venous blood was sampled immediately after CRC patients had receivedgeneral anaesthesia, moments before surgery. In all patients, an intravenous cannula was used to collect blood into 7 mlvacutainers containing sodium ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA). The first 7 ml of blood was discarded in order to reducethe risk of contamination from skin epithelial cells. Subsequently, 30 ml samples were collected at one-minute intervals (five 6 mlaliquots per 30 ml sample).ResultsThe limit of detection (LOD) of the methodology described in the present study was determined at 10 DLD-1 cells/ml of sampleas fluorescence measured with a spectrofluorometer. Fluorescence activated cell sorting (FACS) analysis and Real Time RTPCRwere also used to evaluate the performance of the method. Ultimately, in comparison to other methods currently in use, wedeveloped a simple, sensitive, and more cost-effective method for the detection of CRC CTCs in human samples. Results wereaccomplished using magnetic bead isolation and subsequent QD fluorescence detection.ConclusionThe present method can be readily adjusted to target a variety of proteins of either the CTCs or the host.

Η ανίχνευση των κυκλοφορούντων καρκινικών κυττάρων (CTCs είναι σημαντική καθώς αυτά προσδιορίζουν τη διασπορά της νόσου και την πιθανότητα ύπαρξης μικρομεταστάσεων οι οποίες δεν είναι ακόμα αντιληπτές με τις κλασσικές μεθόδους.Επομένως, τα κυκλοφορούντα καρκινικά κύτταρα αποτελούν προγνωστικό δείκτη σε μεταστατικό καρκίνο.H ανάπτυξη μεθοδολογίας για την έγκαιρη ανίχνευση των CTCs με χρήση ειδικών νανοανιχνευτών βασισμένων σε αντισώματα συζευγμένα με κβαντικά κοκκία σεληνιούχου καδμίου (QDs σε συνδυασμό με το μαγνητικό ανοσοδιαχωρισμό των CTCs.Αντισώματα έναντι των βιοδεικτών EpCAM και CK , κυτταρική σειρά DLD- , μαγνητικά σφαιρίδια συζευγμένα με στρεπταβιδίνη,QDs. Η μέθοδος βασίζεται στον ανοσομαγνητικό διαχωρισμό των CTCs από τα σωματικά υγρά και τη σύζευξή τους με QDs, χρησιμοποιώντας ειδικά αντισώματα. Το σήμα ανίχνευσης λαμβάνεται από τον φθορισμό των QDs. Η μέθοδος χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση των κυττάρων DLD- και CTCs από δείγματα περιφερικού αίματος ασθενών.Ως ελάχιστο όριο ανίχνευσης ορίστηκαν τα 10 CTCs/ml. Η ποσοτικοποίηση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση φασματοφθοριόμετρου ενώ η απόδοση της μεθόδου στα δείγματα των ασθενών ελέγχθηκε με κυτταρομετρία ροής και Real timePCR.Η μέθοδος που αναπτύξαμε συμβάλλει σημαντικά στην ανίχνευση των κυκλοφορούντων καρκινικών κυττάρων, με χαμηλότερο κόστος και σε λιγότερο χρόνο από τις σήμερα χρησιμοποιούμενες μεθοδολογίες, διασφαλίζοντας παράλληλα μεγάλη ευαισθησία.