Μελέτη παραμέτρων που διέπουν την ανάπτυξη του μικροοργανισμού Listeria monocytogenes σε χαμηλές θερμοκρασίες

Abstract

This study investigated factors influencing the growth of Listeria monocytogenes at low temperatures. During growth experiments of L. monocytogenes in chemically defined medium Modified Welshimer’s Broth (MWB) at low temperatures, a novel observation was recorded. Specifically, the direct monitoring of L. monocytogenes growth by surface-plating on Brain Heart Infusion agar plates, using direct colony count method, revealed that the pathogen’s growth at low temperatures is frequently biphasic, with growth curves displaying five (lag-log-lag-log-stationary), rather than three (lag-log-stationary) distinct segments. Potential influencing factors for L. monocytogenes biphasic growth in MWB at low temperatures were investigated and the kinetic parameters of the growth of the pathogen, using the Baranyi equation, were determined as a function of these factors. The factors investigated were: the incubation temperature, the initial inoculum size, the medium composition -by ten-fold increasing the concentration of selected groups of medium constituents- and the bacterial strain. The growth of L. monocytogenes Scott A in MWB at 7°C, 10°C and 14°C was biphasic and independent of growth rate; at 18°C growth followed the typical, single phase sigmoid growth curve, while at 4°C no growth was observed. The tested alterations in the composition of the growth medium did not affect the biphasic nature of L. monocytogenes Scott A growth at 7°C and no association could be established with specific strain serotypes or genetic lineages. However, the level of the initial inoculum appeared to influence the shape of the growth curve, and there was a trend towards typical sigmoid (monophasic) growth curves in trials with higher initial inocula. The effect of the concentration of cryoprotectants in the growth medium on the growth characteristics of L. monocytogenes at refrigeration temperatures was studied in experiments with different concentrations of glycine betaine and carnitine and growth temperatures; these factors’ influence on the growth of L. monocytogenes was investigated in strain Scott A. The addition of cryoprotectants positively affected growth, with a more pronounced effect at lower temperatures. Growth at 4°C was only observed in trials with added cryoprotectants. At the 7°C-trials, addition of compatible solutes resulted in growth amelioration which was evidenced through an increase in the growth rates and/or a reduction in the duration of lag phases. At 10°C the addition of either compatible solute did not appear to confer any cryoprotective effect, while higher final cell densities were obtained in cultures in the absence of cryoprotectants. The growth of L. monocytogenes Scott A at 7°C was, in most trials, bi-phasic and at 10°C growth curves were all bi-phasic. At, 4°C all obtained growth curves were consistently of the typical single-phase sigmoid type. The increase in the growth temperature resulted in higher growth rates, and this effect was more pronounced in cultures not containing cryoprotectants.

Η παρούσα μελέτη επικεντρώθηκε στην εξέταση παραγόντων που επιδρούν στην ανάπτυξη της Listeria monocytogenes σε χαμηλές θερμοκρασίες με ιδιαίτερη έμφαση στη συμβολή συγκεκριμένων κρυοπροστατευτικών ουσιών του περιβάλλοντος. Κατά την καλλιέργεια της L. monocytogenes στο χημικώς καθορισμένο υπόστρωμα Modified Welshimer’s Broth, καταγράφηκε μια νέα παρατήρηση σχετικά με την καμπύλη ανάπτυξης του βακτηρίου. Ειδικότερα, η άμεση παρακολούθηση της ανάπτυξης της L. monocytogenes με επιφανειακή εξάπλωση δειγμάτων από καλλιέργειες σε επιλεγμένα χρονικά διαστήματα, σύμφωνα με τη μέθοδο απαρίθμησης αποικιών, σε πλούσιο, μη εκλεκτικό, στερεό μέσο αποκάλυψε ότι το παθογόνο ακολουθεί ένα διφασικό μοτίβο ανάπτυξης σε χαμηλές θερμοκρασίες, με την παρατηρούμενη καμπύλη ανάπτυξης να εμφανίζει πέντε διακριτά τμήματα. Διερευνήθηκαν πιθανοί παράγοντες που επηρεάζουν το φαινόμενο της διφασικής ανάπτυξης της L. monocytogenes στο υπόστρωμα σε χαμηλές θερμοκρασίες και προσδιορίστηκαν οι κινητικές παράμετροι της ανάπτυξης του παθογόνου ως συνάρτηση των συγκεκριμένων παραγόντων, χρησιμοποιώντας την εξίσωση Baranyi. Εξετάστηκε η επίδραση της θερμοκρασίας επώασης, του μεγέθους του ενοφθαλμίσματος, της σύνθεσης του καλλιεργητικού μέσου και του βακτηριακού στελέχους. Η ανάπτυξη του στελέχους L. monocytogenes Scott Α στο υπόστρωμα στους 7°C, 10°C και 14°C ήταν διφασική και ανεξάρτητη του ρυθμού ανάπτυξης, στους 18°C η ανάπτυξη ήταν μονοφασική (τυπική σιγμοειδής καμπύλη ανάπτυξης), ενώ στους 4°C δεν παρατηρήθηκε ανάπτυξη. Οι τροποποιήσεις στη σύνθεση του υποστρώματος που δοκιμάστηκαν δεν επηρέασαν τη διφασική φύση της ανάπτυξης του στελέχους L. monocytogenes Scott A στους 7°C. Επίσης, δεν παρατηρήθηκε εξάρτηση της μορφής της καμπύλης ανάπτυξης ανάλογα με τον ορότυπο ή τη γενετική καταγωγή των στελεχών. Από την άλλη μεριά, το επίπεδο του ενοφθαλμίσματος φάνηκε να επηρεάζει τη μορφή της καμπύλης ανάπτυξης. Η ανάπτυξη στις δοκιμές ακολουθούσε σιγμοειδή, μονοφασικού τύπου, καμπύλη, καθώς αυξάνονταν η τιμή του ενοφθαλμίσματος. Επιπλέον, μελετήθηκε η επίδραση της συγκέντρωσης των κρυοπροστατευτικών ουσιών στο υπόστρωμα στην ανάπτυξη της L. monocytogenes σε θερμοκρασίες ψύξης. Ειδικότερα, εξετάστηκε η επίδραση της περιεκτικότητας του υποστρώματος στα κρυοπροστατευτικά βεταΐνη και καρνιτίνη σε συνάρτηση με τη θερμοκρασία ανάπτυξης στα χαρακτηριστικά ανάπτυξης του στελέχους Scott A. Οι κρυοπροστατευτικές ουσίες βοήθησαν την ανάπτυξη του μικροοργανισμού, με εντονότερη δράση στις χαμηλότερες θερμοκρασίες. Συγκεκριμένα, στους 4°C δεν παρατηρήθηκε ανάπτυξη απουσία των κρυοπροστατευτικών ουσιών, σε αντίθεση με όταν αυτές ήταν παρούσες. Στους 7°C ο μικροοργανισμός αναπτύχθηκε ανεξάρτητα της προσθήκης ή μη κρυοπροστατευτικών, με τις ουσίες να βοηθούν την ανάπτυξη του μικροοργανισμού αυξάνοντας τον ρυθμό ανάπτυξης και μειώνοντας τη χρονική διάρκεια της λανθάνουσας φάσης. Στους 10°C δεν παρατηρήθηκε σημαντική επίδραση των κρυοπροστατευτικών ουσιών, ενώ σε καλλιέργειες που δεν είχαν προστεθεί κρυοπροστατευτικά σημειώθηκε μεγαλύτερη τελική μικροβιακή συγκέντρωση. Η ανάπτυξη της L. monocytogenes στους 7°C πραγματοποιήθηκε ως επί τω πλείστον σε δύο φάσεις, στους 10°C ήταν διφασική, ενώ στους 4°C η ανάπτυξη περιγράφτηκε με μια τυπική σιγμοειδή καμπύλη. Αύξηση της θερμοκρασίας ανάπτυξης οδήγησε σε ταχύτερους ρυθμούς ανάπτυξης, επίδραση που ήταν εντονότερη σε καλλιέργειες που δεν περιείχαν κρυοπροστατευτικά.