Μελέτη μηχανισμών κυτταρικού επαναπρογραμματισμού μεσεγχυματικών βλαστικών κυττάρων διαφορετικής προέλευσης

Abstract

Transcription-factor-induced reprogramming of somatic cells to pluripotency requires profound alterations in the epigenetic landscapes, making the process extremely ineffective. Previous studies suggest that macroH2A1.2 (mH2A1.2), an unusual histone variant restricted and highly preserved among vertebrates, acts as a barrier to cellular reprogramming of both mouse and human somatic cells. So far, mH2A1.2 has been negatively correlated with gene expression. However, recent studies in our laboratory suggest that singular mH2A1.2-nucleosomes occupy transcription start sites (TSSs) of subsets of both expressed and non-expressed genes in a cell type-specific manner and the strategic position and stabilization of mH2A1.2-nucleosomes in specific human promoters define robust gene expression patterns. Therefore, the aim of this work was to identify new insights of the mechanism of cellular reprogramming and to determine the actual role of mH2A1.2 during cellular reprogramming in human cells. To this aim, the first step in this study was to establish a universal method for the generation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) derived from human primary cells. Taking into consideration that the stoichiometry of the reprogramming factors, Oct4, Sox2, Klf4 and c-Myc (OSKM), is important for reprogramming, a polycistronic dox-inducible lentiviral vector bearing all four factors in a single cassette was constructed. Therefore, the strong influence of cell type on reprogrammability, including the efficiency and the kinetics of the process, was determined by examining three distinct human cell types of mesodermal origin. In addition, human iPS cell lines verified for their ability to self-renew and to differentiate into other cell types were derived from human fibroblasts, since they can be easily isolated from skin biopsies from healthy donors and patients while they represent the most commonly used primary somatic cell type for the generation of iPSCs to be applied in therapeutic approaches. The second step in this study was to determine the phenotypical and transcriptional changes during cellular reprogramming of human primary fibroblasts and compare with those determined in murine cells. The similarities highlighted by these data confirm that the process of cellular reprogramming is conserved between the two organisms even though they exibit differential kinetics and efficiency. The third step in this study was to elucidate the role of mH2A1.2 during cellular reprogramming of human fibroblasts. Though its repressive role during this process has been determined in mouse cells and human keratinocytes, the underlying molecular mechanism by which mH2A1.2 blocks this process remains elusive. In the present study, it was also confirmed its repressive role in human skin fibroblasts. Noteworthy, the initial elongated shape of human fibroblasts is maintained upon mH2A1.2 overexpression indicating that the cells are trapped at the very early stages of the process, namely at the MET since the activation of E-CAD expression is blocked. On the other hand, the N-CAD to E-CAD transcriptional switch was facilitated upon the knock-down of mH2A1. By using chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) coupled with previously determined transcriptional profiling (RNA-seq) in human fibroblasts and in human ESCs, significant new insights were provided about the mechanism by which mH2A1.2 restrains reprogramming. In the first place, it was confirmed that the mechanism of mH2A1.2-nucleosome occupancy is performed in a cell type-specific manner in the cells of the same organism but it is evolutionary conserved in the same cell type between different species as it was identified by the comparison with those determined in murine cells. In addition, it was verified the genome-wide distribution of singular mH2A1.2-nucleosomes on the TSSs of subsets of both expressed and non-expressed genes. What should be emphasized is that their presence in human fibroblasts was correlated with non-expressed genes without showing any particular preference for occupying specific gene segments, whereas in hESCs it was related to expressed genes with high frequency at the region around the TSS. Furthermore, by examining the DNA sequences underlying mH2A1.2-nucleosomes was revealed that in human fibroblasts mH2A1.2-nucleosomes mask activator binding sites in non-expressed genes, whereas in expressed genes mask repressor binding sites. By contrast, in hESCs, there was no specific mH2A1.2 DNA code underlying its footprint. However, the predominant localization of mH2A1.2-nucleosomes around the TSS of active genes indicated that mH2A1.2-nucleosomes may play a fine-tuning role in transcription. Since the mechanistic insights gained by the study on mH2A1.2-nucleosome occupancy did not sufficiently explain how mH2A1.2 blocks cellular reprogramming, mH2A1.2-centered cell-specific gene regulatory networks (GRNs) based on experimentally verified interactions integrating data from the RNA-seq experiments were constructed. The reconstructed GRNs support the cellular phenotypes of human fibroblasts and human ESCs which are established and maintained by the temporal regulation and dynamics of networks of co-regulated genes while they acquire functional robustness at least via the ability of strategically positioned mH2A1.2-nucleosomes on key regulatory genes to minimize variability in gene expression despite the existence of extensive crosstalk between the various factors perturbing the normal system. Taken together all these data, mH2A1.2 appears to function as a gate keeper of cell fates by limiting progression to alternative cell fates.

Ο επαγώμενος από τους μεταγραφικούς παράγοντες κυτταρικός επαναπρογραμματισμός στην πολυδύναμη κατάσταση απαιτεί ριζικές αλλαγές στο επιγενετικό τοπίο των σωματικών κυττάρων καθιστώντας την όλη διαδικασία εξαιρετικά αναποτελεσματική. Προηγούμενες μελέτες υποδεικνύουν ότι η macroH2A1.2 (mH2A1.2), μία ασυνήθιστη ιστονική ποικιλομορφή που απαντά μόνο στα σπονδυλωτά με υψηλό βαθμό συντήρησης, δρα ως εμπόδιο στον κυτταρικό επαναπρογραμματισμό των σωματικών κυττάρων τόσο του ποντικού όσο και του ανθρώπου. Μέχρι στιγμής, η mH2A1.2 ήταν συνδεδεμένη με την αρνητική ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης. Ωστόσο, σε πρόσφατες μελέτες του εργαστηρίου μας αποδείχθηκε ότι τα mH2A1.2-μονονουκλεοσώματα απαντούν στο σημείο έναρξης της μεταγραφής (TSS) σε υποσύνολο τόσο εκφραζομένων όσο και μη-εκφραζομένων γονιδίων με ειδικό για τον κάθε κυτταρικό τύπο τρόπο καθώς επίσης ότι η στρατηγική θέση και σταθεροποίηση αυτών σε συγκεκριμένους υποκινητές γονιδίων ανθρώπου ορίζουν εύρωστα πρότυπα γονιδιακής έκφρασης. Επομένως, σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν η βαθύτερη κατανόηση του μηχανισμού του κυτταρικού επαναπρογραμματισμού και ο προσδιορισμός του ρόλου της mH2A1.2 σε αυτή τη διαδικασία κατά τη μελέτη κυττάρων ανθρώπου. Για το σκοπό αυτό, πρώτο βήμα της μελέτης ήταν ο σχεδιασμός μεθοδολογίας γένεσης επαγώμενων πολυδύναμων κυττάρων (iPSCs) ανθρώπου. Λαμβάνοντας υπόψη ότι η στοιχειομετρία των παραγόντων επαναπρογραμματισμού, Oct4, Sox2, Klf4 και c-Myc (OSKM), είναι σημαντική για τον επαναπρογραμματισμό, κατασκευάστηκε ένας επαγώμενος από δοξικυκλίνη λεντιϊκός φορέας που φέρει την κασέτα έκφρασης και των τεσσάρων παραγόντων. Ως εκ τούτου, η ισχυρή επίδραση του κάθε κυτταρικού τύπου στην ικανότητα να επαναπρογραμματίζονται, συμπεριλαμβάνοντας την αποτελεσματικότητα και την κινητική της διαδικασίας, προσδιορίστηκε κατά τη μελέτη τριών διακριτών κυτταρικών τύπων ανθρώπου μεσοδερμικής προέλευσης. Επιπλέον, κυτταρικές σειρές iPS ανθρώπου που επαληθεύτηκαν για την πολυδυναμία και την ικανότητά τους να διαφοροποιούνται σε άλλους κυτταρικούς τύπους δημιουργήθηκαν από ινοβλάστες δέρματος ανθρώπου καθότι απομονώνονται εύκολα με βιοψία από το δέρμα υγειών εθελοντών και ασθενών ενώ αποτελούν το πιο κοινό κυτταρικό τύπο για τη γένεση iPSCs και την εφαρμογή τους σε θεραπευτικές προσεγγίσεις. Δεύτερο βήμα της παρούσας μελέτης ήταν ο προσδιορισμός των φαινοτυπικών και των μεταγραφικών αλλαγών κατά τον κυτταρικό επαναπρογραμματισμό ινοβλαστών ανθρώπου και σύγκριση με τα αποτελέσματα που προέρχονται από την αντίστοιχη μελέτη στο ποντίκι. Οι ομοιότητες που τονίζονται από τα αποτελέσματα της παρούσας ανάλυσης επιβεβαιώνουν ότι η διαδικασία του κυτταρικού επαναπρογραμματισμού είναι συντηρημένη μεταξύ των δύο οργανισμών ακόμη κι αν εμφανίζουν διαφορετική κινητική και αποτελεσματικότητα. Τέλος, τρίτο βήμα της μελέτης ήταν η διερεύνηση του ρόλο της mH2A1.2 κατά τη διάρκεια του κυτταρικού επαναπρογραμματισμού των ινοβλαστών ανθρώπου. Ακόμη κι αν ο κατασταλτικός της ρόλος έχει προσδιοριστεί στα κύτταρα του ποντικού και στα κερατινικά κύτταρα του ανθρώπου ο υποκείμενος μηχανισμός με τον οποίο η mH2A1.2 μπλοκάρει αυτή τη διαδικασία παραμένει άγνωστος. Στην παρούσα εργασία επιβεβαιώθηκε ο κατασταλτικός της ρόλος και στους ινοβλάστες δέρματος ανθρώπου. Αξιοσημείωτο είναι ότι το αρχικό επίμηκες σχήμα των κυττάρων διατηρείται κατά την υπερέκφραση της mH2A1.2 υποδεικνύοντας ότι τα κύτταρα παγιδεύονται στα πρώιμα στάδια της διαδικασίας όταν λαμβάνει χώρα η ΜΕΤ καθότι εμποδίζεται η ενεργοποίηση της έκφραση της E-CAD. Αντίθετα, η μεταγραφική εναλλαγή της N-CAD στην E-CAD διευκολύνεται κατά την αποσιώπηση αυτής. Από την αλληλούχιση των DNA θραυσμάτων της ανοσοκατακρημνισμένης χρωματίνης (ChIP-seq) σε συνδυασμό με το μεταγραφικό προφίλ που είχε προηγούμενα ταυτοποιηθεί (RNA-seq) στους ινοβλάστες ανθρώπου και στα ESCs ανθρώπου, νέα δεδομένα προκύπτουν για το μηχανισμό με τον οποίο η mH2A1.2 εμποδίζει τον επαναπρογραμματισμό. Καταρχήν, επιβεβαιώθηκε ότι ο μηχανισμός εναπόθεσης των mH2A1.2–νουκλεοσωμάτων είναι ειδικός για τον κάθε κυτταρικό τύπο του ίδιου οργανισμού αλλά εξελικτικά συντηρημένος για τον ίδιο κυτταρικό τύπο μεταξύ διαφορετικών ειδών όπως προέκυψε από τη σύγκριση με το ποντίκι. Επιπλέον, επαληθεύτηκε η ευρεία γενομική κατανομή των mH2A1.2-μονονουκλεοσωμάτων στο TSSs υποσυνόλου τόσο εκφραζομένων όσο και μη-εκφραζομένων γονιδίων. Αξιοσημείωτη όμως είναι η παρουσία των mH2A1.2-μονονουκλεοσωμάτων στα μη-εκφραζόμενα γονίδια στους ινοβλάστες ανθρώπου χωρίς να εμφανίζει ιδιαίτερη προτίμηση εντοπισμού σε συγκεκριμένες γονιδιακές θέσεις, ενώ στα ESCs ανθρώπου στα εκφραζόμενα γονίδια με μεγάλη συχνότητα εντοπισμού σε περιοχές που εκτείνονται γύρω από το TSS. Περαιτέρω εξέταση των DNA αλληλουχίων που υπόκεινται στις θέσεις εντοπισμού των mH2A1.2-νουκλεοσωμάτων αποκάλυψε ότι στους ινοβλάστες ανθρώπου τα mH2A1.2-νουκλεοσώματα καλύπτουν θέσεις πρόσδεσης ενεργοποιητών στα μη-εκφραζόμενα γονίδια, ενώ στα εκφραζόμενα γονίδια καλύπτουν θέσεις πρόσδεσης καταστολέων. Αντίθετα, στα ESCs ανθρώπου, δεν παρατηρήθηκε κάποιος συγκεκριμένος DNA κώδικας στις αντίστοιχες θέσεις εντοπισμού. Ωστόσο, η παρουσία αυτών κυρίως γύρω από το TSS των ενεργών γονιδίων υποδηλώνει τον πιθανό ρόλο τους στην άριστη ρύθμιση της μεταγραφής. Καθότι οι πληροφορίες σχετικά με το μηχανισμό λειτουργίας των mH2A1.2-νουκλεοσωμάτων δεν ερμηνεύουν επαρκώς τον τρόπο με τον οποίο η mH2A1.2 εμποδίζει τον κυτταρικό επαναπρογραμματισμό, σχεδιάστηκαν γονιδιακά ρυθμιστικά δίκτυα (GRNs) ειδικά για τον κάθε κυτταρικό τύπο που εστιάζουν στους στόχους της mH2A1.2 βασισμένα σε πειραματικά επαληθευμένες αλληλεπιδράσεις ενσωματώνοντας τα αποτελέσματα της RNA-seq ανάλυσης. Οι αναπαραστάσεις των GRNs υποστηρίζουν το κυτταρικό φαινότυπο των ινοβλαστών ανθρώπου και των ESCs ανθρώπου τα οποία καθιερώνονται και διατηρούνται από την παροδική ρύθμιση και δυναμική των δικτύων των συ-ρυθμιζόμενων γονιδίων ενώ αποδεικνύεται ότι η στρατηγική θέση εντοπισμού των mH2A1.2-νουκλεοσωμάτων σε ρυθμιστικά γονίδια με ρόλο «κλειδί» μειώνει τη μεταβλητότητα στη γονιδιακή έκφραση παρά την εκτεταμένη διασταυρούμενη αλληλεπίδραση μεταξύ διαφόρων παραγόντων που διαταράσσουν το φυσιολογικό σύστημα. Συνεπώς, η mH2A1.2 φαίνεται να προστατεύει την απόφαση του κυττάρου περιορίζοντας τη μετάβαση σε εναλλακτικές κυτταρικές μορφές.