Ανίχνευση μεταλλάξεων στο γονίδιο του παράγοντα VIII σε παιδιά με βαριά αιμορροφιλία Α

Abstract

Haemophilia A is the most common X-linked bleeding disorder which is caused by a spectrum of mutations in the factor VIII gene (FVIII). Point mutations, deletions and insertions have been detected in all 26 exons of the FVIII gene of Haemophilia A patients and cause phenotypes of variable severity. Most mutations are individual ones but some variants are recurrent because they occur at specific hot spots. Two types of recurrent inversions in the FVIII gene are known to cause severe haemophilia A: intron 22 and intron 1 inversions with an incidence of 40-50% and 2-5%, respectively. The type of mutation plays an important role in the FVIII inhibitor formation. The aim of the present study was to determine the spectrum of mutations in the FVIII gene in patients with severe haemophilia A. Genomic DNA samples of 96 unrelated severe haemophilia A children were analyzed by Southern blotting and Long-Distance PCR for the detection of intron 22 inversion. Two complementary multiplex PCRs were used for the detection of intron 1 inversion in patients without intron 22 inversion. Direct sequencing of the coding region of the FVIII gene was used to identify the mutations in 14 unrelated patients who were negative for both inversions. The sequences were compared with the (HAMSTeRs;http:hadb.org.uk) database. The intron 22 inversion occurred in 50% (48/96) of patients with severe haemophilia A in the present study. All patients tested for intron 1 inversion were negative for this mutation. Direct sequencing of the coding regions and the exon /intron bounderies of FVIII gene revealed 13 different mutations, and five had not been previously described in the international database which supports the diversity of FVIII gene mutation. These novel mutations included one large deletion, two small deletions, one nonsense and one splice-site mutation. Among the 13 mutations, four were nonsense, one was large deletion four were small deletions, two were missense and two were splice-site mutations. Five patients out of the 13 developed FVIII inhibitors, one patient with large deletion, two patients with small deletions and two patients with nonsense mutations. Also, in the patients with intron 22 inversion the occurrence of inhibitor-positive cases was 34% and the clinical phenotype in 92% of patients was severe. Knowledge of the disease-causing mutation may have clinical significance for appropriate patient management, as it may help predict patients at risk of developing inhibitors to FVIII replacement therapy. It may also accurately determine the carrier status of at risk family members and prenatal diagnosis.

Η αιμορροφιλία Α είναι η πιο γνωστή φυλοσύνδετη διαταραχή της αιμόστασης, οφείλεται σε ποικιλία μεταλλάξεων στο γονίδιο του παράγοντα VIII, οι οποίες προκαλούν φαινότυπο ποικίλης βαρύτητας. Η μοριακή βάση της αιμορροφιλίας Α είναι εξαιρετικά ετερογενής και σχεδόν κάθε οικογένεια φέρει τη δική της μετάλλαξη. Οι πιο συχνές μεταλλάξεις είναι οι αναστροφές που συμβαίνουν στα εσώνια 22 και 1, με συχνότητα 40-50% και 2-5%, αντίστοιχα. Οι υπόλοιπες είναι διασκορπισμένες σε όλο το μήκος του γονιδίου του παράγοντα VIII. Ανερμηνεύσιμες μεταλλάξεις, μεγάλες ελλείψεις και αναστροφές θεωρείται ότι έχουν μεγάλο κίνδυνο ανάπτυξης αναστολέων. Ο σκοπός της παρούσης μελέτης ήταν να προσδιορισθούν οι μεταλλάξεις στο γονίδιο του FVIII σε παιδιά με βαριά αιμορροφιλία Α. DNA από 96 παιδιά με βαριά αιμορροφιλία Α αναλύθηκε, αρχικά, για τις δύο αναστροφές των εσωνίων 22 και 1. Σε 14 παιδιά που δεν έφεραν τις αναστροφές έγινε ανίχνευση των μεταλλάξεων, με τη μέθοδο προσδιορισμού της αλληλουχίας του DNA κατά Sanger. H αναστροφή του εσωνίου 22 βρέθηκε σε ποσοστό 50% (48/96), ενώ η αναστροφή του εσωνίου 1 δεν ανιχνεύθηκε σε κάποιο παιδί. Η ανάλυση DNA των εξωνίων καθώς και των ορίων εξωνίων/εσωνίων έδειξε 13 διαφορετικές μεταλλάξεις εκ των οποίων 5 δεν αναφέρονται στη διεθνή βάση δεδομένων (HAMSTeRs;http:hadb.org.uk). Συγκεκριμένα, βρέθηκαν δύο μικρές ελλείψεις, μία μεγάλη, μία ανερμηνεύσιμη και μία σε θέση ματίσματος. Σε ένα παιδί δεν εντοπίσθηκε μετάλλαξη. Από τις 13 μεταλλάξεις, 4 (31%) αφορούν σε μικρές ελλείψεις, 4 (31%) σε σημειακές που οδηγούν σε κωδικόνιο λήξης, 2 (15%) σε θέση ματίσματος, 2 (15%) σε παρερμηνεύσιμες και 1 (8%) αφορά σε μεγάλη έλλειψη. Από τα 61 παιδιά στα οποία ταυτοποιήθηκαν οι μοριακές βλάβες, τα 21 (34%) ανέπτυξαν αναστολέα. Συγκεκριμένα, ανιχνεύθηκε αναστολέας σε 16 παιδιά με αναστροφή του εσωνίου 22, σε 2 με ανερμηνεύσιμες μεταλλάξεις, σε 2 με μικρές ελλείψεις και σε ένα με μεγάλη έλλειψη. Οι ασθενείς που έφεραν την αναστροφή του εσωνίου 22 είχαν βαρύ κλινικό φαινότυπο σε ποσοστό 92%. Η γνώση της γενετικής βλάβης θα βοηθήσει ώστε ο μεν ασθενής να επωφεληθεί από πρώιμη εκτίμηση της πιθανότητας για ανάπτυξη αναστολέα και την επιλογή κατάλληλων θεραπευτικών χειρισμών, αλλά, επίσης, και η οικογένεια να αξιοποιήσει τη γνώση για τον έλεγχο των γυναικών φορέων και την αποφυγή γέννησης νέου παιδιού με βαριά αιμορροφιλία Α, μέσω της προγεννητικής διάγνωσης.