Ανάπτυξη μεθόδων φαρμακευτικής ανάλυσης με την τεχνική υγροχρωματογραφίας - φασματομετρίας μαζών και με σχηματισμό παραγώγων

Abstract

In the first part of the dissertation two different derivatization reagents were compared (dansyl chloride και phenyl isothiocyanate) for glucosamine determination by LC-ESI-MS. LOQ and matrix effect derived from plasma were used for comparison purposes. Although, the slopes of calibration curves of standard solutions, in both cases, were equivalent in the case of phenyl isothiocyanate LOQin plasma was higher ~2.5 compared to dansyl chloride. Finally, from the matrix effect study ion suppression ~50% in dansyl chloride and ion enhancement ~65% in phenyl isothiocyanate were obsereved. In the second part, an analytical method for the determination of D-penicillamine in human plasma was optimized and validated, by using LC-ESI-MS combined with derivatization procedure. Various steps of sample treatment, which include 2 different derivatization reagents (ethyl chloroformate and methyl acrylate), 3 reducing reagents (ascorbic acid, NaBH4 and TCEP), solvents for protein precipitation and organic solvents for sample clean up with liquid-liquid extraction were studied and optimized. In the third part, an LC-APCI-MS method was optimized and validated for the determination of fosfomycin in plasma. In this work derivatization via phase transfer catalysis was used, and both conditions of phase transfer catalysis and derivatization procedure were optimized. Chromatographic conditions were studied and optimized, as well.

Στο πρώτο μέρος της διατριβής πραγματοποιήθηκε σύγκριση δύο αντιδραστηρίων παραγωγοποίησης δανσυλοχλωρίδιο (dansyl chloride) και ισοθειοκυανικό φαινύλιο (phenyl isothiocyanate) στο LC-ESI-MS για τον προσδιορισμό της γλυκοζαμίνης. Ως μέτρο σύγκρισης τέθηκε το LOQ της μεθόδου και η επίδραση της μήτρας προερχόμενη από τα συστατικά του πλάσματος. Στην περίπτωση του ισοθειοκυανικού φαινυλίου το LOQ της μεθόδου ήταν ~2,5 φορές πιο υψηλό στο πλάσμα σε σχέση με το δανσυλοχλωρίδιο, παρόλο που οι κλίσεις των καμπυλών αναφοράς πρότυπων διαλυμάτων ήταν ισοδύναμες. Τέλος, από τη μελέτη επίδρασης της μήτρας βρέθηκε ότι το δανσυλοχλωρίδιο εμφανίζει καταστολή ιοντισμού κατά ~50%, ενώ το ισοθειοκυανικό φαινύλιο εμφανίζει ενίσχυση ιοντισμού κατά ~65%.Στο δεύτερο μέρος της διατριβής αναπτύχθηκε και επικυρώθηκε μέθοδος προσδιορισμού της D-πενικιλλαμίνης σε ανθρώπινο πλάσμα με την τεχνική LC-ESI-MS σε συνδυασμό με παραγωγοποίηση. Μελετήθηκαν και βελτιστοποιήθηκαν διάφορα στάδια προκατεργασίας του δείγματος που περιλαμβάνει δύο διαφορετικά αντιδραστήρια παραγωγοποίησης χλωρομυρμηκικού αιθυλεστέρα (ethyl chlorofomate) και ακρυλικού μεθυλεστέρα (methyl acrylate), 3 αναγωγικά αντιδραστήρια (ασκορβικό οξύ, τετραϋδροβορικό νάτριο και TCEP), διαλύτες για την καταβύθιση πρωτεϊνών και οργανικοί διαλύτες, καθώς και μίγματα αυτών, για τον καθαρισμό του δείγματος με υγρό-υγρό εκχύλιση. Στο τρίτο μέρος της διατριβής αναπτύχθηκε και επικυρώθηκε αναλυτική μέθοδος προσδιορισμού φωσφομυκίνης με LC-APCI-MS σε ανθρώπινο πλάσμα. Στην εργασία αυτή γίνεται χρήση της κατάλυσης μεταφοράς φάσης σε κατάλυση και βελτιστοποιήθηκαν οι παράμετροι κατάλυσης μεταφοράς φάσης, η διαδικασία παραγωγοποίησης καθώς και οι χρωματογραφικές συνθήκες.