Επιλογή και χαρακτηρισμός θερμοανθεκτικών υδρολυτικών ενζύμων από μεταγονιδιωματικές βιβλιοθήκες οργανισμών από ακραία περιβάλλοντα

Abstract

Hydrolases are an enzyme class that catalyze the modification of a wide range ofsubstrates and can be employed in various industrial biotransformations towards theproduction of a plethora of value-added products. Their use can substitute the classicharsh chemical treatments used in industry with more eco-friendly procedures as theyrequire milder operation conditions and offer high precision transformations due to theenzyme’s highly selective nature. Even though the advantages of using enzymes inindustrial biotechnology are many, their use is restricted by the fact that commonbiocatalysts cannot function under high temperatures and other harsh conditions thatoccur in industrial environments. The cost involved in material cooling and eliminationof other denaturing conditions before adding the biocatalyst in order to protect it fromdeactivation is often prohibitive and this is the reason why enzymes do not take overthe chemical treatments very often. The employment of thermostable and overall stablebiocatalysts can alleviate the need for cooling and elimination of denaturing conditions,making enzymic biotransformations economically viable. For this reasons,biotechnologists have been focusing their efforts on the discovery of thermostablehydrolases. In nature, such enzymes can be found in the protein toolbox ofextremophiles, the organisms that have been adapted to extreme conditions throughevolutionary pressure. Due to the fact that 99% of the microbial biodiversity cannot becultivated using standard laboratory techniques, for years, the vast majority ofextremophiles and their proteins have remained unexplored. Recently, biotechnologistshave gained access to this enormous protein space through metagenomic analysis which overcomes the bottleneck of microbiological cultivation. Within this thesis, which was carried out in the framework of the multinational “Hotzyme” consortium, bioinformatic analysis and in vivo functional screening of metagenomic libraries originating from extreme environments, led to the discovery and characterisation of three novel and thermostable hydrolases. The corresponding genes coding for these enzymes were isolated from metagenomic DNA and the recombinant proteins were produced in bacterial Ε. coli cells, followed by purification and biochemical characterisation. Briefly, the first enzyme that was isolated and studied is the CelDZ1 cellulase. CelDZ1 was retrieved through bioinformatic screening of an enrichment sample originating from an Icelandic hot spring. CelDZ1 is a GH5 cellulase, with a pHoptimum at 5 and a temperature optimum at 70 oC. Interestingly, CelDZ1 is hyperhalostable and halotolerant as it is able to maintain high catalytic activity at near saturating salt concentrations. In cooperation with our colleagues, the crystal structure of CelDZ1 was studied and revealed that the new enzyme lacks the defined sugar binding subsite which is present in all homologues proteins. The second enzyme that was isolated and characterized within this study, is the EstDZ2 esterase, which was retrieved through bioinformatic screening of a Russian hot spring metagenome. The new esterase is thermostable with a half-life of more than six hours at 60 oC, and exhibits exceptional stability against high concentrations of organic solvents. Phylogenetic analysis revealed that EstDZ2 opens a new family of lipolytic enzymes termed Family XV, which bares the catalytic motif GHSAG. The study of its structural model implied that EstDZ2 is missing the largest part of the “protein lid” present in the structures of all members of the closest IV family. Finally, the third enzyme of this thesis is the EstDZ3 esterase. EstDZ3 is hyperthermostable as it retains its catalytic activity after several hours of incubation at nearboiling temperatures. The corresponding gene coding for this new enzyme was retrieved through in vivo functional screening of the genetic material of a bacterial strain isolated from an in situ enrichment of a Chinese hot spring. Apart from the exceptional thermostability, EstDZ3 also exhibits great stability against high concentrations of organic solvents. Furthermore, the study of EstDZ3’s structural model revealed that the enzyme bares a “subdomain insertion” similar to the one reported for the closest structural homologue that is expected to have a determinant role for EstDZ3’s catalytic properties. All three hydrolases, exhibit low homology to known and characterized proteins, a fact that combined with their interesting biochemical profile renders them not only candidate enzymes for biotechnological applications but also molecular models forstudying the thermostabilization mechanisms of proteins and more.

Oι υδρολάσες είναι μια οικογένεια ενζύμων που καταλύουν την υδρόλυση ενόςμεγάλου εύρους υποστρωμάτων και μπορούν να χρησιμοποιηθούν στη βιομηχανικέςβιομετατροπές προς την παραγωγή πληθώρας προϊόντων υψηλής προστιθέμενης αξίας. Η χρήση τους δύναται να αντικαταστήσει τις καθαρά χημικές μεθόδους επεξεργασίαςτων υλικών καθώς απαιτεί ηπιότερες συνθήκες, και είναι αποδοτικότερη καιακριβέστερη λόγω της υψηλής εξειδίκευση των ενζύμων, οδηγώντας έτσι σε μια πιο «πράσινη» βιομηχανία. αρότι τα πλεονεκτήματα χρήσης των υδρολασών στη βιομηχανία είναι πολλά, η χρήση τους περιορίζεται από το γεγονός ότι οι συμβατικοί βιοκαταλύτες καθίστανται ανενεργοί στις υψηλές θερμοκρασίες και σε άλλες «αντίξοες» σύνηθες που συχνά επικρατούν στις βιομηχανικές διεργασίες. Το κόστος ψύξης και απομάκρυνσης των αποδιατακτικών παραγόντων πριν την προσθήκη των ενζύμων προς αποφυγή της αποδιάταξής τους, είναι τις περισσότερες φορές απαγορευτικό και αυτός είναι ο λόγος που περιορίζει την αντικατάσταση των κλασσικών χημικών κατεργασιών από ενζυμικές μετατροπές. ια λύση σε αυτό το πρόβλημα, που καθιστά τις ενζυμικές διεργασίες οικονομικά βιώσιμες, αποτελεί η χρήση θερμοσταθερών και εν γένει σταθερών υδρολασών. Για το λόγο αυτό, το ενδιαφέρον των βιοτεχνολόγων έχει στραφεί τα τελευταία χρόνια στην ανακάλυψη θερμοσταθερών βιοκαταλυτών. Στη φύση, τα ένζυμα αυτά απαντώνται στην πρωτεϊνική φαρέτρα των ακραιόφιλων οργανισμών, των οργανισμών δηλαδή που έχουν προσαρμοστεί σε ακραία περιβάλλοντα μέσω της εξελικτικής πίεσης. Επειδή όμως το 99% της μικροβιακής βιοποικιλότητας δεν μπορεί να καλλιεργηθεί στο εργαστήριο, για χρόνια, η συντριπτική πλειοψηφία των οργανισμών αυτών και των πρωτεϊνών τους παρέμεινε ανεξερεύνητη. Τα τελευταία χρόνια, μέσω της μεταγονιδιωματικής ανάλυσης που απαλείφει την ανάγκη της μικροβιολογικής καλλιέργειας, οι βιοτεχνολόγοι απέκτησαν πρόσβαση στον τεράστιο πρωτεϊνοχώρο των ακραιόφιλων οργανισμών. Σε αυτή τη διατριβή, η οποία εκπονήθηκε στο πλαίσιο της διεθνούς κοινοπραξίας “Hotzyme”, η βιοπληροφορικής και η in vivo λειτουργικής σάρωσης μεταγονιδιωματικών βιβλιοθηκών που προέκυψαν από δειγματοληψίες ακραίων ενδιαιτημάτων, οδήγησε στην ανακάλυψη τριών νέων θερμοσταθερών υδρολασών. Τα αντίστοιχα γονίδια που κωδικοποιούν για αυτές τις υδρολάσες εντοπίστηκαν και ανακτήθηκαν από τις μεταγονιδιωματικές βιβλιοθήκες, και μετά από ετερόλογη έκφραση τους σε βακτηριακά κύτταρα E. coli, τα ανασυνδυασμένη ένζυμααπμονώθηκαν και μελετήθηκαν βιοχημικά. Συνοπτικά, το πρώτο ένζυμο που απομονώθηκε είναι η θερμοανθεκτική κυτταρινάση CelDZ1. Η CelDZ1 προέκυψε από τη βιοπληροφορική σάρωση δείγματος εμπλουτισμού σλανδικής θερμοπηγής και ανήκει στη οικογένεια GH5. Η CelDZ1 είναι μια θερμοανθεκτική, οξεόφιλη κυτταρινάση με βέλτιστες συνθήκες δράσης το pH 5 και τους 70 oC. αράλληλα, η νέα κυτταρινάση παρουσιάζει εντυπωσιακή αλοανθεκτικότητα και αλοσταθερότητα αφού διατηρεί την ενεργότητα της σε συγκεντρώσεις αλάτων που τείνουν στον κορεσμό. Σε συνεργασία με τους εταίρους μας μελετήθηκε η κρυσταλλική της δομή η οποία αποκάλυψε ότι η CelDZ1 διαφέρει από τις ομόλογες πρωτεΐνες καθώς υπολείπεται της υποπεριοχής-2 πρόσδεσης των σακχαριτών. Το δεύτερο ένζυμο που απομονώθηκε και μελετήθηκε σε αυτή τη διατριβή είναι η εστεράση EstDZ2, η οποία προέκυψε μέσω βιοπληροφορικής σάρωσης του μεταγονιδιωματικού υλικού ωσικής θερμοπηγής. Η νέα εστεράση είναι θερμοσταθερή, με χρόνο ημιζωής πάνω από έξι ώρες στους 60 οC και παρουσιάζει εξαιρετική σταθερότητα σε υψηλές συγκεντρώσεις οργανικών διαλυτών. Η φυλογενετική μελέτη της νέας εστεράσης έδειξε ότι η EstDZ2 εγκαινιάζει μια νέα οικογένεια λιπολυτικών ενζύμων που φέρει το χαρακτηριστικό καταλυτικό αμινοξικό μοτίβο GHSAG, την οποία και ονομάσαμε ικογένεια XV. αράλληλα, η μελέτη του μοντέλου της τρισδιάστατης δομής της EstDZ2 έδειξε ότι πιθανότατα το νέο ένζυμο να υπολείπεται μεγάλο μέρος της χαρακτηριστικής δομής του «πρωτεϊνικού καπακιού» που συναντάται στις δομές των μελών της κοντινότερης οικογένειας V των λιπολυτικών ενζύμων.Τέλος, το τρίτο ένζυμο που απομονώθηκε και μελετήθηκε σε αυτή τη διατριβήείναι η εστεράση EstDZ3, ένα υπερ-θερμοσταθερό ένζυμο που διατηρεί τηνκαταλυτική του δράση ακόμα και μετά από πολύωρη επώαση σε θερμοκρασίες κοντά στο βρασμό. H νέα εστεράση εντοπίστηκε μετά από in vivo λειτουργική σάρωση του γενετικού υλικού βακτηριακού στελέχους που απομονώθηκε από δείγμα εμπλουτισμού κινεζικής θερμοπηγής. έρα από την εξαιρετική θερμοσταθερότητα της, η ΕstDZ3 παρουσιάζει σταθερότητα και σε υψηλές συγκεντρώσεις οργανικών διαλυτών. Παράλληλα, η μελέτη του μοντέλου της δομής της, έδειξε ότι πρόκειται για ένα ένζυμο που φέρει ένα πρωτεϊνικό ένθετο της δομής α/β, παρόμοιο με αυτό της πλησιέστερης δομικά πρωτεΐνης, που προβλέπεται να παίζει καθοριστικό ρόλο στην εκλεκτικότητα του ενζύμου. Και τα τρία νέα ένζυμα παρουσιάζουν χαμηλή ομολογία με ήδη γνωστές και χαρακτηρισμένες πρωτεΐνες κάτι που σε συνδυασμό με τα ενδιαφέροντα βιοχημικά και δομικά τους χαρακτηριστικά τα καθιστά τόσο υποψήφιους βιοκαταλύτες γιαβιοτεχνολογικές εφαρμογές όσο και μοριακά μοντέλα για τη μελέτη της θερμοσταθερότητας των πρωτεϊνών και όχι μόνο.