Ρυθμιστικά Τ-κύτταρα και επαγόμενη από απόπτωση φλεγμονή

Abstract

The present study was designed to explore the relationship of immune regulation with apoptotic pathways and inflammation.Liver biopsy specimens from 101 patients with liver diseases [as CHB (before treatment, on relapse and on longterm remission), CHC, NAFLD, autoimmune diseases] and synovium specimens from 27 patients with osteoarthritis (OA) of knee and hip were evaluated. The mRNA expression levels of the following genes were assessed by Real-time PCR:-FOXP3, IL10, TGFB and CD4, CD8 (Tregs and T-cell markers) -IL1B, TNFA (pro-inflammatory cytokines)-FAS, FASL, TRAIL (apoptosis mediators)-PD1, PDL1, PDL2 and IL2, IFNG (markers of T-cell exhaustion and restoration)-TGF-B1,B2,B3, INHB-A,Β,C,Ε, ALK4, ALK5, SMAD2,3,4,7, CTGF (TGFB/Activins pathway).Protein expression of molecules with significant expression alterations were assessed by Western blot and immunohistochemistry.Significant increase of FOXP3 was observed in all hepatic disease groups compared to controls, which was positively correlated with inflammation intensity. Fas, FasL, and TRAIL expression was also significantly elevated. On CHB remission state the expression of FOXP3, IL10, TGFB1, PD1, PDL1, FASL, and CD8 was reduced, while FOXP3, PD1, PDL1, and CD8 transcripts were positively correlated to liver inflammatory stage. FOXP3 expression was also strongly correlated with the expression of FAS, FASL, and TRAIL in OA synovium, whilst TRAIL was elevated in cases with hypertrophic OA. Finally, SMAD7 was significantly elevated and TGFB1, SMAD2, SMAD3, and CTGF expression was reduced in patients with CHB on remission compared to those at diagnosis. NAFLD patients also exhibited increased SMAD7 compared to untreated chronic viral hepatitis patients and non-responders. SMAD7 expression was correlated with the severity of inflammation.The observed mobilization of Tregs in the liver followed a certain pattern, depending upon the inflammatory stage and the expression of apoptosis mediators. The strong correlations between apoptosis mediators and immunoregulation were also confirmed in chronically inflamed OA synovium. The down-regulation of immunosuppressive liver environment observed in the longterm remission state suggests that the contraction of the inhibitory pathways is possibly a mere consequence of the diminution of liver inflammation. Finally, overexpression of SMAD7 in cases of low-grade fibrosis seems to be able to suppress the TGFB fibrotic effect rendering SMAD7 as a potent therapeutic target.

Η μελέτη επιχείρησε να διερευνήσει τη συσχέτιση της ανοσορρύθμισης με παράγοντες της φλεγμονής και της απόπτωσης. Συλλέχθηκαν βιοψίες ήπατος 101 ασθενών με χρόνιες ηπατοπάθειες (ΧΗΒ προ θεραπείας, σε υποτροπή και ύφεση, ΧΗC, NAFLD και αυτοάνοσα νοσήματα), και δείγματα αρθρικού υμένα (ΑΥ) 27 ασθενών με οστεοαρθρίτιδα (ΟΑ) γόνατος και ισχίου. Με Real-time-PCR προσδιορίστηκε η mRNA έκφραση των:-FOXP3, IL10, TGFB (δείκτες Tregs) και CD4, CD8 (δείκτες Τ-κυττάρων)-IL1B, TNFA (φλεγμονώδεις κυτταροκίνες)-FAS, FASL, TRAIL (μεσολαβητές απόπτωσης)-PD1, PDL1, PDL2 και IL2, IFNG (δείκτες εξάντλησης και αποκατάστασης Τ-κυττάρων)-TGFB1,-Β2,-Β3, INHB-A,Β,C,Ε, ALK4, ALK5, SMAD2,3,4,7, CTGF (οδός TGFB/Ακτιβινών).Τέλος, πραγματοποιήθηκε πρωτεϊνικός εντοπισμός μορίων με σημαντικές διαφορές έκφρασης με Western blot και ανοσοϊστοχημεία. Οι ασθενείς με χρόνιες ηπατοπάθειες παρουσίασαν θεαματική αύξηση του FOXP3 σε σχέση με τους μάρτυρες (που συσχετιζόταν με το στάδιο της φλεγμονής) με παράλληλη αύξηση των FAS, FASL και TRAIL. Στη μακροχρόνια ύφεση της ΧΗΒ υπήρξε μείωση των FOXP3, IL10, TGFB1, PD1, PDL1, FASL και CD8 συγκριτικά με ασθενείς στη διάγνωση, ενώ η έκφραση των FOXP3, PD1, PDL1 και CD8 σχετιζόταν με το στάδιο της φλεγμονής. Η έκφραση του FOXP3 επίσης συσχετίστηκε ισχυρά με τα FAS, FASL και TRAIL στους ασθενείς με ΟΑ. Επιπλέον, το TRAIL υπερεκφραζόταν σε ασθενείς με υπερτροφικό φαινότυπο ΟΑ. Τέλος, παρατηρήθηκε υπερέφραση του αναστολέα SMAD7, που συσχετίστηκε με τη φλεγμονή, με ταυτόχρονη μείωση των TGFB1, SMAD2, SMAD3 και CTGF σε ασθενείς με ΧΗΒ σε ύφεση σε σέση με ασθενείς στη διάγνωση. Οι ασθενείς με NAFLD εμφάνισαν αντίστοιχη αύξηση του SMAD7 αλλά με αύξηση των TGFB1, TGFB3, TGFBR1, SMAD2 και SMAD4 συγκριτικά με ασθενείς με ΧΗC και ΧΗΒ προ θεραπείας και σε υποτροπή.Παρατηρήθηκε αύξηση των Tregs στις χρόνιες ηπατοπάθειες, που ακολουθεί ένα πρότυπο ανάλογα με το στάδιο της φλεγμονής και τους μεσολαβητές της απόπτωσης. Η ισχυρή συσχέτιση της απόπτωσης με το FOXP3 επιβεβαιώθηκε και στην ΟΑ. Η μείωση της ανοσοκαταστολής στη μακροχρόνια ύφεση της ΧΗΒ είναι μάλλον συνέπεια της μειωμένης ηπατικής φλεγμονής. Τα δεδομένα ενισχύουν το μοντέλο λειτουργίας των Tregs σχετικά με την ιστική βλάβη λόγω φλεγμονής προκαλούμενης από αυξημένη απόπτωση, συνηγορώντας υπέρ του προστατευτικού ρόλου τους σε τέτοιες καταστάσεις. Τέλος, η υπερέκφραση του SMAD7 σε περιπτώσεις χαμηλού βαθμού ίνωσης φαίνεται ικανή να μειώσει την ινωτική δράση του TGFB καθιστώντας το μόριο πιθανό θεραπευτικό στόχο.