TLR7-διαμεσολαβούμενη ανοχή: μια νέα μορφή κυτταρικής ανοσοθεραπείας για την πρόληψη της οξείας νόσου του μοσχεύματος κατά του ξενιστή

Abstract

Acute graft-versus-host disease (aGvHD), which is characterized by damage of epithelial surfaces in target organs mediated by alloreactive donor-derived T-cells, remains the leading cause of treatment-related morbidity and mortality after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation. Conventional strategies to prevent or treat aGvHD are often ineffective while they result in generalized immunosuppression and increased susceptibility to infections. Consequently, the development of alternative anti-aGvHD approaches becomes imperative. Toll-like receptors (TLRs) are a family of highly conserved pattern-recognition receptors (PRRs) of the innate immune system, that play a critical role in the host defense against pathogens. Although the role of LPS-TLR4 interaction during the early phase of aGvHD development has been previously recognized, subsequent studies regarding the TLR involvement in aGvHD pathophysiology, appeared extremely controversial. Recently, regulatory mechanisms of TLR tolerance induced by repeated low doses of specific agonists, have been recognized in the context of autoimmunity. Here we first studied the TLR2, TLR4, TLR7 and TLR9 mRNA and protein expression levels, in hematopoietic and non-hematopoietic tissues of patients with established aGvHD. In addition, we analysed the TLR signaling pathway of the peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) of aGvHD patients, at steady-state and after specific TLR2, TLR4, TLR7 and TLR9 agonist stimulation. We then sought to explore, whether the ex vivo TLR2, TLR4, TLR7 and TLR9 tolerance induction in donor splenocytes or purified T-cells, by low-dose specific-ligand stimulation, could decrease allo-reactivity and prevent aGvHD in a mismatched transplantation murine model. Finally, we tested whether TLR tolerant human T-cells maintain their Graft-versus Infection (GvI) and Graft-versus Leukemia (GvL) effect. Our results indicate a distinct TLR expression profile in both hematopoietic and non-hematopoietic cells of aGvHD patients, but no particular differences in the mRNA expression of TLR signaling molecules. Interestingly, PBMCs from aGvHD patients, activated via specific TLR agonists, demonstrated strong hyporesponsiveness. TLR2, TLR4 and TLR7, but not TLR9 tolerance was succesfully induced in mouse splenocytes. Nevertheless, only the ex vivo, R848-induced TLR7-tolerance, either in splenocytes or in purified CD3+ T-cells, was able to prevent aGvHD in vivo, persisting for at least 30 days post-BMT. This anti-GvHD effect was associated with distinct cellular and molecular signatures over unmanipulated counterparts or differently TLR-tolerized cells, both ex vivo and in vivo. The tolerant phenotype was characterized by a shift of T-lymphocytes towards Tregs, repression of inflammatory signaling pathways and innate immune responses, as well as up-regulation of negative mediators of inflammation. The anti-GvHD tolerance effect was specific to TLR7, as TLR7-/- T-cells failed to prevent aGvHD lethality in vivo. Importantly, TLR7-tolerant T-cells maintained the immunological memory and produced virus-specific T-cells upon antigen encounter, despite the down-regulation of some innate immunity pathways. Finally, TLR7-tolerant T-cells infused in a murine acute myeloid leukemia (AML) xenotransplantation model, decreased the leukemic load similarly to untreated DLIs, indicating maintenance of their GvL effect. Given the reversible immune reprogramming of TLR7 tolerant T-cells, exerting decreased alloreactivity during the critical phase of aGvHD development while maintaining the beneficial GvI and GvL effects, we propose the ex vivo TLR7 tolerance induction in donor lymphocytes as an effective and clinically applicable prophylactic tool against aGvHD.

Η οξεία νόσος του μοσχεύματος κατά του ξενιστή (aGvHD) χαρακτηρίζεται από την καταστροφή της επιθηλιακής επιφάνειας ποικίλων οργάνων-στόχων, που οφείλεται στην αλλοδραστικότητα των Τ-λεμφοκυττάρων του δότη και αποτελεί τη σημαντικότερη αιτία θνητότητας και νοσηρότητας μετά από αλλογενή μεταμόσχευση αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων. Οι συμβατικές στρατηγικές πρόληψης ή θεραπείας της νόσου είναι συχνά αναποτελεσματικές και οδηγούν σε γενικευμένη ανοσοκαταστολή και αυξημένη ευαισθησία σε ευκαιριακές λοιμώξεις, καθιστώντας αναγκαία την ανάπτυξη εναλλακτικών μεθόδων αντιμετώπισης. Οι ανάλογοι των Toll υποδοχείς (TLRs) ανήκουν στην οικογένεια των υψηλά συντηρημένων υποδοχέων αναγνώρισης προτύπων (PRRs) της έμφυτης ανοσίας, αποτελώντας την πρώτη γραμμή άμυνας του ανοσοποιητικού συστήματος έναντι παθογόνων μικροοργανισμών. Αν και ο ρόλος της LPS-TLR4 αλληλεπίδρασης στην ενεργοποίηση των Τ-λεμφοκυττάρων του δότη κατά την πρώιμη φάση ανάπτυξης της aGvHD είναι καλά τεκμηριωμένος, περαιτέρω έρευνες στην εμπλοκή των TLRs με την παθοφυσιολογία της νόσου απέδωσαν αντικρουόμενα αποτελέσματα. Επιπλέον, πρόσφατα έχουν περιγραφεί ρυθμιστικοί μηχανισμοί TLR ανοχής, επαγόμενης από χαμηλές δόσεις TLR αγωνιστών, στο πλαίσιο της αυτοανοσίας. Με βάση τα παραπάνω, διερευνήσαμε την έκφραση των TLR2, TLR4, TLR7, TLR9 σε μεταγραφικό και πρωτεϊνικό επίπεδο, τόσο σε αιμοποιητικούς όσο και σε μη-αιμοποιητικούς ιστούς-στόχους ασθενών με εγκατεστημένη οξεία νόσο του μοσχεύματος κατά του ξενιστή (aGvHD). Παράλληλα, σε μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος (PBMCs) ασθενών με aGvHD, διεξήχθη εις βάθος ανάλυση της TLR σηματοδότησης και διερευνήθηκε η απόκρισή τους σε ειδικούς TLR2, TLR4, TLR7 και TLR9 αγωνιστές, εξετάζοντας τις μεταβολές της TLR σηματοδότησης των κυττάρων σε συνθήκες ενεργοποίησης. Επίσης, σε ζωικό μοντέλο ασύμβατης μεταμόσχευσης, διερευνήσαμε τη δυνατότητα ex vivo επαγωγής ανοχής στους υπό μελέτη TLRs, με παρατεινόμενη έκθεση σπληνοκυττάρων ή κεκαθαρμένων Τ-λεμφοκυττάρων σε χαμηλές δόσεις ειδικών αγωνιστών, ως μέσο μείωσης της αλλοδραστικότητας και πρόληψης της aGvHD. Τέλος, επιβεβαιώσαμε τη δυνατότητα επαγωγής ανοχής σε T-κύτταρα ανθρώπου, εξετάζοντας παράλληλα εάν τα «απευαισθητοποιημένα» Τ-κύτταρα διατηρούν την αντι-ιική (GvI) και αντι-λευχαιμική (GvL) τους δράση. Από τα αποτελέσματα προέκυψε ένα εντελώς διακριτό πρότυπο έκφρασης των TLRs τόσο στα αιμοποιητικά όσο και στα μη-αιμοποιητικά κύτταρα των ασθενών με aGvHD, ενώ δεν εντοπίστηκαν σημαντικές διαφοροποιήσεις στην έκφραση μορίων της TLR σηματοδότησης. Η ενεργοποίηση ωστόσο των PBMCs με τους TLR αγωνιστές κατέδειξε ισχυρή υποδραστικότητα των κυττάρων σε συνθήκες εγκατεστημένης νόσου. Επιπλέον, επιτεύχθηκε επαγωγή ανοχής σε λεμφοκύτταρα μυών διαμέσου των TLR2, TLR4 και TLR7, αλλά όχι TLR9, μετά από απευαισθητοποίησή τους με τους αντίστοιχους αγωνιστές. Ωστόσο, μόνο η R848-επαγόμενη TLR7 ανοχή σε σπληνοκύτταρα ή κεκαθαρμένα CD3+ T-κύτταρα, η οποία διατηρήθηκε για τουλάχιστον 30 ημέρες μετά τη μεταμόσχευση, απέτρεψε την εμφάνιση aGvHD in vivo. Η μείωση της αλλοδραστικότητας συσχετίστηκε, τόσο ex vivo όσο και in vivo, με διακριτή κυτταρική και μοριακή υπογραφή των TLR7 ανοχικών κυττάρων σε σχέση με τις υπόλοιπες κυτταρικές ομάδες: παρατηρήθηκε στροφή των T-λεμφοκυττάρων προς ανοσορυθμιστικό (Treg) φαινότυπο, καταστολή φλεγμονωδών σηματοδοτικών μονοπατιών και ανοσοαποκρίσεων της έμφυτης ανοσίας καθώς και υπερέκφραση αρνητικών διαμεσολαβητών της φλεγμονής. Η αντι-aGvHD δράση μέσω επαγόμενης ανοχής στα Τ-λεμφοκύτταρα αποδείχθηκε ειδική για τον TLR7, καθώς τα TLR7-/- T-κύτταρα δεν κατάφεραν, in vivo, να μειώσουν τη σχετιζόμενη με την aGvHD νοσηρότητα. Παρά την υποέκφραση μονοπατιών σχετιζόμενων με την έμφυτη ανοσία, τα TLR7-ανοχικά Τ-λεμφοκύτταρα διατήρησαν την ανοσολογική τους μνήμη εκπτύσσοντας ειδικά αντι-ιικά T-κύτταρα, έπειτα από επανέκθεσή τους σε EBV και CMV αντιγόνα. Τέλος, η χορήγηση TLR7-ανοχικών Τ-κυττάρων ανθρώπου (DLIs), σε μοντέλο ξενομεταμόσχευσης οξείας μυελογενούς λευχαιμίας (AML) προκάλεσε μείωση του λευχαιμικού φορτίου στους λήπτες, ισοδύναμη με την αντίστοιχη των μη επεξεργασμένων λεμφοκυττάρων του δότη, αποδεικνύοντας σαφή διατήρηση της αντι-λευχαιμικής (GvL) τους δράσης. Προτείνουμε την TLR7-διαμεσολαβούμενη ανοχή των λεμφοκυττάρων του δότη ως ένα μη-παρεμβατικό και κλινικά εφαρμόσιμο εργαλείο πρόληψης της aGvHD, καθώς ο παροδικός ανοσολογικός επαναπρογραμματισμός που προκαλεί στα Τ-λεμφοκύτταρα δότη, μειώνει την αλλοδραστικότητά τους στην κρίσιμη για την aGvHD περίοδο, διατηρώντας ωστόσο την ευεργετική για τον λήπτη αντι-ιική και αντι-λευχαιμική τους δράση.