Προσδιορισμός της διαφορικής μοριακής υπογραφής τριών αιμοποιητικών ιστών κατά την ανθρώπινη οντογένεση και εφαρμογή της στη θεραπευτική των αιμοσφαιρινοπαθειών β-τύπου

Abstract

Hemoglobinopathies are a heterogeneous group of hereditary disorders resulting from mutations in the globin genes. Clinically, the most important hemoglobinopathies are sickle cell anemia and β-thalassemia that are caused by qualitative and quantitative disorders, respectively. The clinical phenotype of patients with β-type hemoglobinopathies varies due to the wide variety of mutations found in the β-globin gene and in genes outside the β-globin locus that are involved in the erythroid and non- erythroid mechanism of regulation of this particular gene expression.Hydroxyurea (HU) is the only pharmaceutical agent approved by the Food and Drug Administration of the United States of America that contributes to the induction of HbF composition and is used to treat sickle cell anemia and β-thalassemia. In the context of precision medicine and considering interindividual variability in HU response, the tailored-made administration of HU is considered necessary towards maximum patient benefit. For this, we need to delineate the mechanisms of interindividual variabilityAccording to current literature data and outcome of our research strategy in the laboratory, single nucleotide polymorphisms within and outside the β-globin complex have been found to be associated both with elevated HbF levels in β-thalassemia patients with mild clinical phenotype and the response of patients with β-type hemoglobinopathies to HU administration.In the present thesis based on the different sites of erythropoiesis in human ontogenesis and the time of switch from γ- to β-globin, the differential transcriptional profile of progenitor erythroid cells from fetal liver, umbilical cord blood and adult peripheral blood were studied by DNA microarray methods. From the list of the differentially expressed genes and after extensive literature search and pathway analysis, we chose to further study the VEGFA gene. This gene was found to be overexpressed in later stages of ontogenesis where low levels of HbF are found.The differential expression of the VEGFA gene was then thoroughly investigated during the differentiation of early erythroid cells from two tissues with high levels of HbF (human fetal liver and umbilical cord blood) in erythroblasts. More specifically, the molecular imprint of BFU-Es, CFU-Es and erythroblasts was analyzed with the RNA sequencing method. The VEGFA gene was found to be overexpressed in the earliest forms of erythroid cells relatively to the more mature forms in these tissues.Subsequently, we explore the role of the VEGFA gene as a modifier of β-thalassemia disease severity and as a pharmacogenomic marker for the response of patients with β-hemoglobinopathies to HU treatment. For this, following in silico analysis, we chose to study the SNPs rs2146323, rs3024997 and rs10434 across VEGFA in Caucasians. In particular, genotyping analysis of the above polymorphisms in five population groups was performed: healthy subjects, non-transfusion dependent β-thalassemia patients, major β-thalassemia patients, and compound heterozygous patients for sickle cell disease and β-thalassemia characterized as responders and non-responders in HU. rs2146323 and rs10434 were analyzed by Sanger sequencing and the Allele-Specific PCR method was employed for rs3024997.rs2146323 was found to be associated with elevated HbF levels and thus the mild phenotype of patients with intermediate β-thalassemia. In contrast, rs3024997 seems to be associated with the most severe clinical phenotype of major β-thalassemia patients. Regarding the correlation of variants in question with response to HU of sickle cell disease/ β-thalassemia patients, rs2146323 was found to be significantly associated.Based on the findings of our study, the VEGFA gene is overexpressed in low HbF context. Also, genotyping analysis’ results hold promise about its use in the individualized treatment of patients with β-hemoglobinopathies.

Οι αιμοσφαιρινοπάθειες είναι μια ετερογενής ομάδα κληρονομικών διαταραχών που προκύπτουν από μεταλλάξεις στα γονίδια των σφαιρινών του ανθρώπου. Από κλινικής άποψης οι πιο σημαντικές είναι η δρεπανοκυτταρική αναιμία και η β-θαλασσαιμία, οι οποίες οφείλονται σε ποιοτικές και ποσοτικές διαταραχές αντίστοιχα. Ο κλινικός φαινότυπος των ασθενών με αιμοσφαιρινοπάθειες β-τύπου ποικίλλει, γεγονός που οφείλεται αφενός στη μεγάλη ποικιλία των μεταλλάξεων που εντοπίζονται στο γονίδιο της β-σφαιρίνης κι αφετέρου, σε γονίδια εκτός του β-γονιδιακού τόπου που εμπλέκονται στον ερυθροειδικό και μη μηχανισμό ρύθμισης της γονιδιακής έκφρασης αυτού.Η υδροξυουρία (HU) αποτελεί το μόνον εγκεκριμένο από τον Οργανισμό Τροφίμων και Φαρμάκων των Ηνωμένων Πολιτειών Αμερικής φαρμακευτικό παράγοντα που συντελεί στην επαγωγή της παραγωγής της HbF και χρησιμοποιείται για τη θεραπεία της δρεπανοκυτταρικής αναιμίας και της β-θαλασσαιμίας. Στα πλαίσια της εξατομικευμένης θεραπείας και λαμβάνοντας υπόψην τη διαφορική απόκριση των ασθενών, η στοχευμένη χορήγηση της HU σε συγκεκριμένους ασθενείς κρίνεται απαραίτητη γεγονός, όμως, που προϋποθέτει την κατανόηση των λόγων που η απόκριση των ασθενών στο φάρμακο διαφοροποιείται.Σύμφωνα με τη διεθνή βιβλιογραφία, αλλά και τα αποτελέσματα ερευνών που έχουν προηγηθεί στο εργαστήριό μας, μονονουκλεοτιδικοί πολυμορφισμοί γονιδίων εντός και εκτός του συμπλέγματος των β-σφαιρινών έχει βρεθεί ότι σχετίζονται με τα αυξημένα επίπεδα HbF σε ασθενείς με β-θαλασσαιμία, οι οποίοι παρουσιάζουν ήπιο κλινικό φαινότυπο, αλλά και με την απόκριση ασθενών με β-τύπου αιμοσφαιρινοπάθειες στη χορήγηση HU ως φαρμακευτική αγωγή.Στην παρούσα διατριβή με βάση τις διαφορετικές θέσεις ερυθροποίησης κατά την οντογένεση του ανθρώπου και το χρόνο μεταστροφής από τη γ- στη β-σφαιρίνη μελετήθηκε το διαφορικό μεταγραφικό προφίλ προγονικών ερυθροειδικών κυττάρων εμβρυϊκού ήπατος, ομφαλοπλακουντικού αίματος και περιφερικού αίματος ενήλικου ατόμου με τη μέθοδο των DNA μικροσυστοιχιών. Από τη λίστα των γονίδιων που εκφράζονταν διαφορετικά μεταξύ αυτών, κατόπιν διερεύνησης της βιβλιογραφίας, αλλά και των μονοπατιών στα οποία εμπλέκονται, επιλέξαμε να μελετήσουμε περαιτέρω το γονίδιο VEGFA. Το συγκεκριμένο γονίδιο βρέθηκε να υπερεκφράζεται στα μεταγενέστερα στάδια της οντογένεσης, εκεί, όπου απαντώνται χαμηλά επίπεδα HbF. Κατόπιν, διερευνήθηκε περαιτέρω η διαφορική έκφραση του γονιδίου VEGFA κατά τη διαφορoποίηση των πρώιμων ερυθροειδικών κυττάρων, δύο ιστών με υψηλά επίπεδα HbF (ανθρώπινο εμβρυϊκό ήπαρ και αίμα από ομφάλιο λώρο ανθρώπου), σε ερυθροβλάστες. Πιο συγκεκριμένα, αναλύθηκε το μοριακό αποτύπωμα των BFU-Es, των CFU-Es και των ερυθροβλαστών με τη μέθοδο της αλληλούχισης του RNA. Το γονίδιο VEGFΑ βρέθηκε να υπερεκφράζεται στις πιο πρώιμες μορφές των ερυθροειδικών κυττάρων σε σχέση με τις πιο ώριμες μορφές σε αυτούς τους ιστούς. Στη συνέχεια, αξιολογήθηκε ο ρόλος του γονιδίου VEGFA ως τροποποιητή της κλινικής εικόνας των ασθενών με β-θαλασσαιμία, αλλά και ως φαρμακογονιδιωματικού δείκτη, όσον αφορά την απόκριση των ασθενών με αιμοσφαιρινοπάθειες β-τύπου στη λήψη HU. Για το σκοπό αυτό, κατόπιν in silico ανάλυσης, επιλέξαμε να μελετήσουμε για τον Καυκάσιο πληθυσμό τους μονονουκλεοτιδικούς πολυμορφισμούς rs2146323, rs3024997 και rs10434 κατά μήκος του γονιδίου VEGFA. Συγκεκριμένα, πραγματοποιήθηκε γονοτύπηση ως προς τους παραπάνω πολυμορφισμούς πέντε πληθυσμιακών ομάδων: υγιή άτομα, ασθενείς με μη εξαρτώμενη μεταγγίσεων β-θαλασσαιμία, ασθενείς με μείζονα β-θαλασσαιμία, ασθενείς διπλά ετερόζυγοι για δρεπανοκυτταρική αναιμία/β-θαλασσαιμία ανταποκρινόμενοι και μη στη χορήγηση HU. Για τους πολυμορφισμούς rs2146323 και rs10434 χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος αλληλούχισης κατά Sanger και για τον πολυμορφισμό rs3024997 η μέθοδος της Αllele-Specific PCR.Η παρουσία του πολυμορφισμού rs2146323 βρέθηκε να σχετίζεται με τα αυξημένα επίπεδα HbF κι άρα τον ήπιο φαινότυπο των ασθενών με μη εξαρτώμενη μεταγγίσεων β-θαλασσαιμία. Αντίθετα, η παρουσία του πολυμορφισμού rs3024997 φαίνεται να σχετίζεται με την πιο βαριά κλινική εικόνα των ασθενών με μείζονα β-θαλασσαιμία. Όσον αφορά τη συσχέτιση των υπό μελέτη πολυμορφισμών με την απόκριση των ασθενών με δρεπανοκυτταρική αναιμία/β-θαλασσαιμία στη λήψη HU, ο πολυμορφισμός rs2146323 βρέθηκε να σχετίζεται σημαντικά.Με βάση τα ευρήματα της παρούσας μελέτης, το γονδίο VEGFA υπερεκφράζεται στα πλαίσια χαμηλών επιπέδων HbF. Επίσης, τα αποτελέσματα της γονοτυπικής ανάλυσης υπόσχονται πολλά, όσον αφορά τη χρήση του στην εξατομικευμένη θεραπεία ασθενών με αιμοσφαιρινοπάθειες β-τύπου.