Περίληψη
Ο σκοπός των πειραμάτων που εκτελέστηκαν σε αυτή τη μελέτη διδακτορικής διατριβής ήταν: 1. Να διερευνηθεί η απόδοση εμπορικών μεθόδων προσδιορισμού της ευαισθησίας στην κολιστίνη σε σύγκριση με τις πρότυπες μεθόδους, ειδικά σε στελέχη με υψηλές τιμές MIC. 2. Να διερευνηθούν οι φαινοτυπικές, γενωμικές και παθογενετικές μεταβολές που σχετίζονται με την ανάπτυξη της αντοχής στην κολιστίνη in vivo. 3. Η πολυκεντρική επιδημιολογική διερεύνηση μιας μεγάλης συλλογής ανθεκτικών στις καρβαπενέμες στελεχών A. baumannii (CRAB), τα οποία απομονώθηκαν από διάφορα νοσοκομεία σε όλη την Ελλάδα. Στο πρώτο στάδιο της μελέτης, έγινε προσδιορισμός των MICs στην κολιστίνη με τη μέθοδο μικροαραιώσεων σε ζωμό (BMD), τη μέθοδο BMD με την προσθήκη 0.002% πολυσορβικoύ οξέος 80, τη μέθοδο αραιώσεων σε άγαρ (AD), το αυτόματο σύστημα Vitek 2 και τις ταινίες διαβαθμισμένης συγκέντρωσης αντιβιοτικού Etest και MIC test strip σε 20 στελέχη A. baumann ...
Ο σκοπός των πειραμάτων που εκτελέστηκαν σε αυτή τη μελέτη διδακτορικής διατριβής ήταν: 1. Να διερευνηθεί η απόδοση εμπορικών μεθόδων προσδιορισμού της ευαισθησίας στην κολιστίνη σε σύγκριση με τις πρότυπες μεθόδους, ειδικά σε στελέχη με υψηλές τιμές MIC. 2. Να διερευνηθούν οι φαινοτυπικές, γενωμικές και παθογενετικές μεταβολές που σχετίζονται με την ανάπτυξη της αντοχής στην κολιστίνη in vivo. 3. Η πολυκεντρική επιδημιολογική διερεύνηση μιας μεγάλης συλλογής ανθεκτικών στις καρβαπενέμες στελεχών A. baumannii (CRAB), τα οποία απομονώθηκαν από διάφορα νοσοκομεία σε όλη την Ελλάδα. Στο πρώτο στάδιο της μελέτης, έγινε προσδιορισμός των MICs στην κολιστίνη με τη μέθοδο μικροαραιώσεων σε ζωμό (BMD), τη μέθοδο BMD με την προσθήκη 0.002% πολυσορβικoύ οξέος 80, τη μέθοδο αραιώσεων σε άγαρ (AD), το αυτόματο σύστημα Vitek 2 και τις ταινίες διαβαθμισμένης συγκέντρωσης αντιβιοτικού Etest και MIC test strip σε 20 στελέχη A. baumannii με υψηλές τιμές MIC στην κολιστίνη, όπως καθορίστηκε από τον προκαταρκτικό έλεγχο ρουτίνας. Στη συνέχεια, αξιολογήθηκαν τα αυτοματοποιημένα συστήματα Vitek 2 και Phoenix100 σε σύγκριση με τη μέθοδο BMD για τον έλεγχο ευαισθησίας στην κολιστίνη σε μία συλλογή από 117 τυχαία επιλεγμένα στελέχη A. baumannii. Η μέθοδος κλιμακωτής διάχυσης και τα αυτοματοποιημένα συστήματα υποεκτίμησαν σημαντικά την αντοχή στην κολιστίνη κι επομένως μπορεί να οδηγήσουν σε ακατάλληλη θεραπεία με κολιστίνη. Τα ευαίσθητα στελέχη με τις εμπορικές μεθόδους και ιδιαίτερα αυτά με MIC στο όριο ευαισθησίας (2 μg/ml) πρέπει να επικυρώνονται με την πρότυπη μέθοδο BMD. Στο επόμενο στάδιο της μελέτης, διερευνήθηκαν τα χαρακτηριστικά και οι μηχανισμοί αντοχής στην κολιστίνη σε δύο ζεύγη γενετικά σχετιζόμενων μεταξύ τους ευαίσθητων στην κολιστίνη/ανθεκτικών στην κολιστίνη (ColS/ColR) κλινικών στελεχών A. baumannii. Τα στελέχη απομονώθηκαν διαδοχικά από τα κλινικά δείγματα δύο ασθενών που νοσηλεύτηκαν στη ΜΕΘ και έλαβαν κολιστίνη για αρκετές ημέρες μεταξύ των απομονώσεων. Τα ColS στελέχη του πρώτου ζεύγους προκάλεσαν διαδοχικές βακτηριαιμίες και του δεύτερου ζεύγους σοβαρή λοίμωξη μαλακών μορίων, ενώ τα αντίστοιχα ColR στελέχη ήταν κυρίως αποικιστές. Σε σύγκριση με τα ColS, τα ColR στελέχη εμφάνισαν σημαντική υπερέκφραση των γονιδίων pmrCAB και είχαν μονήρεις μεταλλάξεις αμινοξέων στην πρωτεΐνη PmrB. Επίσης, τα CοlR στελέχη έδειξαν σημαντικά μειωμένη ανάπτυξη, σχετική ικανότητα ανάπτυξης και ικανότητα σχηματισμού βιομεμβράνης. Η συγκριτική ανάλυση ολόκληρου του γωνιδιώματος μεταξύ των στελεχών του κάθε ζεύγους ανίχνευσε αρκετές αλλαγές. Στο τελευταίο στάδιο της μελέτης, ερευνήσαμε την αντοχή στα αντιβιοτικά, τα γονίδια καρβαπενεμασών και την κλωνική συγγένεια 194 κλινικών στελεχών CRAB, τα οποία συλλέχθηκαν τυχαία κατά τη διάρκεια του 2015 από 11 τριτοβάθμια νοσοκομεία σε όλη την Ελλάδα. Τα πιο δραστικά αντιβιοτικά ήταν η τριμεθοπρίμη/σουλφαμεθοξαζόλη (34,6% των στελεχών ήταν ευαίσθητα), η μινοκυκλίνη (71,6%), η κολιστίνη (72,7%) και η τιγεκυκλίνη (MICs50/90, 1/2 μg/ml). Η εθνική αυτή μελέτη έδειξε ότι τα CRAB στελέχη στα Ελληνικά νοσοκομεία σήμερα παράγουν, σχεδόν αποκλειστικά, την καρβαπενεμάση OXA-23 (98,5%) και ανήκουν κυρίως στον κλώνο IC2 (80,9%) και σε μικρότερο βαθμό στον IC1 (18,6%).
περισσότερα
Περίληψη σε άλλη γλώσσα
The purpose of the experiments performed in the current PhD thesis was: 1. The evaluation of the performance of commercial methods for determining colistin susceptibility compared to standard methods, especially on isolates with elevated MIC values. 2. The investigation of the phenotypic, genomic and pathogenic changes associated with the development of colistin resistance in vivo. 3. The multicentre epidemiological investigation of a large collection of carbapenem-resistant A. baumannii (CRAB) isolates, which were recoved from various hospitals throughout Greece. At the first stage of the study, colistin MICs were determined by broth microdilution (BMD), BMD with 0.002% polysorbate 80, agar dilution (AD), the automated system Vitek 2, and the gradient tests Etest and MIC test strip on 20 A. baumannii isolates with provisionally elevated colistin MICs by routine susceptibility testing. Also, we evaluated Vitek 2 and Phoenix100 automated systems compared with BMD for colistin susceptibi ...
The purpose of the experiments performed in the current PhD thesis was: 1. The evaluation of the performance of commercial methods for determining colistin susceptibility compared to standard methods, especially on isolates with elevated MIC values. 2. The investigation of the phenotypic, genomic and pathogenic changes associated with the development of colistin resistance in vivo. 3. The multicentre epidemiological investigation of a large collection of carbapenem-resistant A. baumannii (CRAB) isolates, which were recoved from various hospitals throughout Greece. At the first stage of the study, colistin MICs were determined by broth microdilution (BMD), BMD with 0.002% polysorbate 80, agar dilution (AD), the automated system Vitek 2, and the gradient tests Etest and MIC test strip on 20 A. baumannii isolates with provisionally elevated colistin MICs by routine susceptibility testing. Also, we evaluated Vitek 2 and Phoenix100 automated systems compared with BMD for colistin susceptibility testing against 117 randomly selected A. baumannii isolates. The gradient diffusion methods and automated systems significantly underestimated the resistance to colistin and may lead to inappropriate colistin therapy. The susceptible isolates, particularly those with MIC on the breakpoint of 2 μg/ml with commercial methods, require validation by the standard method BMD. At the next stage of the study, the characteristics and the mechanisms of colistin resistance in two genetically indistinguishable with each other colistin-susceptible/colistin-resistant (ColS/ColR) pairs of Α. baumannii clinical isolates were investigated. The isolates were successively recovered from clinical specimens of two patients during their hospitalization in ICU, while between ColS/ColR isolations the patients received colistin for several days. The ColS isolates of the first pair caused sequential bloodstream infections and the ColS isolates of the second pair a severe soft tissue infection, while the respective ColR isolates were mainly colonizers. Compared with the ColS, the ColR isolates overexpressed significantly the pmrCAB genes and had single aminoacid shifts in PmrB protein. The ColR isolates showed significantly decreased growth, relative fitness and biofilm formation compared with those of the ColS counterparts. The whole-genome sequencing comparison of strain pairs identified several changes. During the last stage of the study, we investigated the antibiotic resistances, carbapenemase gene content and clonal relatedness of 194 single-patient CRAB clinical isolates collected randomly during 2015 from 11 tertiary hospitals throughout Greece. The most active antibiotics were trimethoprim/sulfamethoxazole (34.6% of isolates susceptible), minocycline (71.6%), colistin (72.7%) and tigecycline (MICs50/90, 1/2 μg/ml). This nationwide study showed that CRAB isolates in Greek hospitals currently produce almost exclusively the OXA-23 carbapenemase (99.5%) and belong mainly to IC2 (80.9%) and, to a lesser extent to IC1 (18.6%).
περισσότερα