Απομόνωση και καθορισμός του γενότυπου ανθεκτικών στη βανκομυκίνη στελεχών Enterococcus spp. από υγιή ζώα και ανθρώπους

Abstract

During the last two decades vancomycin-resistant enterococci (VRE), have emerged as important nosocomial pathogens, due to the widespread use of glycopeptides, mainly vancomycin, in hospitals. Meanwhile, the use of glycopeptide avoparcin as growth promoter in food-producing animals resulted also in the emergence of VRE in livestock worldwide indicating that they might be a potential reservoir for vancomycin resistance determinants. The use of avoparcin has been banned from 1997 in the European Union (Commission Directive 97/6 EC).According to updated epidemiological data, Greek reports showed higher rates for clinical vancomycin-resistant Enterococcus faecium (VREF) compared to the majority of European countries. The aim of this study was to investigate the prevalence of VRE isolated from farm animals (broilers, pigs and calves) and humans in close association to them (slaughterers), the determination of their van genotype as well as the evaluation of their possible epidemiological relationships with clinical VRE sharing the same geographical regions in Greece and at the same period of time.A total of 500 caecal samples of broilers were collected in two poultry slaughterhouses. The samples originated from 8 broiler farms in Northern Greece. During the same time period, cecal samples of sixty (60) fecal samples of healthy calves originated from seven (7) farms in northern Greece and 250 cecal samples of healthy fattening pigs from six (6) farms in northern and central Greece, were collected in two animal slaughterhouses. Moreover, during the same period, stool samples were collected from 50 poultry slaughterers and 50 slaughterers working at the corresponding slaughterhouses where broilers and pigs and calves were slaughtered. The isolation of VRE was performed using selective enrichment with media supplemented with vancomycin (6 mg/l).In addition, 63 human clinical VREF, isolated at the same period of time, were included in this study of which 48 originated from adult (n=13) and neonate (n=35) samples from Hippokratio University hospital whereas 15 originated from adult samples from Larissa University hospital.All presumptive VRE were tested by the Kirby-Bauer method for their susceptibilities to vancomycin and teicoplanin. The Minimun Inhibitory Concentrations (MICs) of vancomycin and teicoplanin were furthermore determined by the broth microdilution method.To detect the presence of van genes, multiplex PCR analyses were performed to all presumptive VRE exhibiting MIC to vancomycin ≥2 μg/ml using primers specific for the vanA, vanB, vanC1-C2, vanD, vanE, vanG, ddl-E. faecium and ddl-E. faecalis genes.A total of 120 VRE were recovered from 112 (22,4%) broiler samples. VREF carrying the vanA gene were predominant recovered from 74 (14,8%) samples from 5 out of 8 (62,5%) broiler farms, while E. gallinarum harboring the vanC gene were recovered from 39 (7,8%) samples obtained also from 5 farms. VRE were recovered from 14 (28%) poultry slaughtetrer samples consisted of 10 (20%) and 4 (8%) positive samples for VREF and E. gallinarum, respectively. Furthermore, one VREF isolate, carrying the vanA gene, was recovered from 1 (1,7%) calve sample. No VRE were recovered from pig samples as well as their slaughterers. The prevalence of broiler VREF indicates their remarkable persistence inbroiler production environment even more than a decade after the avoparcin ban and without any apparent glycopeptide selection. Additionally to their susceptibility testing to vancomycin and teicoplanin, all presumptive VRE isolates, were tested for their susceptibilities to 12 antimicrobials. Broiler VREF were constantly resistant to tetracycline (100%) whereas the most common trait among clinical VREF was resistant to ampicillin (93,7%) and penicillin (93,7%). In contrast, low resistance rates to tetracycline (9,5%) and ampicillin (16,5%) were observed among clinical and broiler VREF, respectively. Concerning poultry slaughterers VREF isolates, they exhibited low resistance to ampicillin (10%), similarly to those observed in broilers and moderate resistance to tetracycline (40%). Another antimicrobial that broiler and clinical VREF alsoexhibited high resistance rates, was erythromycin (54,4% and 57,1%, respectively). Analysis of Antimicrobial Resistance Profiles (ARPs) revealed 53 distinct types, with only 5 of them shared among isolates from the different sources. Meanwhile, 54,4% of broiler and 92,1 % of clinical VREF were multiresistant (resistant to 5 antimicrobial classes) whereas only 10% of poultry slaughterer VREF were multiresistant.The different resistance rates in combination with the existence of variant ARPs among isolates from the different sources (broilers, calves, poultry slaughterers, hospitalized patients) may reflect the broad (different) spectrum of selection pressure of antimicrobial agents used in each source.The relationship of antimicrobial resistance profiles (ARPs) among VREF isolates from the different sources, was determined using discriminant analysis (DA), based on all 14 antimicrobials tested. Broiler and human clinical VREF were classified to their corresponding source at a rate of 100% and 85.7%, respectively, showing a clear discrimination and association with their source. In contrast, the classification rate of poultry slaughterer VREF was just 50% indicating their low source specificity, with 40% of them classified closely to broiler source due to their sharing common ARPs.PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis) analysis was performed to investigate the epidemiological relationship of VREF isolates due to its high discriminatory power. PFGE analysis revealed patterns clearly related to their source. Meanwhile, a high genetic diversity within each source (broilers, poultry slaughterers, hospitalized patients) demonstrated by the existence of more than one clusters, was observed. Specifically, 71 out of 79 broiler VREF were grouped into 4 distinct clusters, designated C1-C4 while 37 out of 63 human clinical isolates appeared to belong also to 4 distinct clusters, designated H1 - H4, exhibiting less than 60% similarity to the C clusters. The remaining broiler, human clinical, poultry slaughterer and the calf VREF isolate, exhibited distinct patterns unrelated to each other or C or H clusters.The comparison of PFGE patterns showed that clinical and broiler VREF isolates created clearly unrelated populations which strongly indicates no clonal spread among the two sources. Moreover, PFGE analysis in this study did not reveal any sharing of clones between broilers and poultry slaughterers despite the close association exhibited by DA, indicating no clonal spread among the two sources. However, the existence of genetically indistinguishable PFGE patterns of VREF isolates from farms of different geographical regions as well as the fact that H1 and H2 clusters shared patterns of isolates with common ARP types from different hospitals, indicate that clonal spread might have occurred inside ech source.The information above may serve as a basis to further clarify whether “specific” vanA genetic elements circulate in broiler production environment or in human environment as well as the mechanisms of VREF long-term persistence in Greece.

Την τελευταία εικοσαετία ανθεκτικοί στη βανκομυκίνη εντερόκοκκοι (vancomycin-resistant enterococci, VRE) έχουν αναδυθεί ως σημαντικά νοσοκομειακά παθογόνα λόγω της ευρείας χρήσης των γλυκοπεπτιδίων, κυρίως της βανκομυκίνης στα νοσοκομεία. Εν τω μεταξύ, η χρήση του γλυκοπεπτιδίου αβοπαρκίνη, ως αυξητικός παράγοντας στα παραγωγικά ζώα και τα πτηνά, είχε επίσης ως αποτέλεσμα την εμφάνιση των VRE σε αυτά παγκοσμίως, δείχνοντας ότι τα ζώα αυτά θα μπορούσαν να αποτελέσουν μια δυνητική δεξαμενή ανθεκτικών στα γλυκοπεπτίδια γενετικών καθοριστών. Η χρήση της αβοπαρκίνης απαγορεύθηκε το 1997 στην Ευρωπαϊκή Ένωση (Οδηγία 97/6 της Ευρωπαϊκής Επιτροπής).Επικαιροποιημένα επιδημιολογικά στοιχεία δείχνουν ότι στην Ελλάδα τα ποσοστά επιπολασμού των κλινικών Enterococcus faecium ανθεκτικών στη βανκομυκίνη (VREF) είναι πολύ υψηλότερα σε σύγκριση με την πλειοψηφία των ευρωπαϊκών χωρών. Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν η διερεύνηση του επιπολασμού των VRE στα παραγωγικά ζώα (πτηνά, χοίρους, βοοειδή) στον Ελλαδικό χώρο καθώς και σε άτομα που σχετίζονταν με αυτά (πτηνοσφαγείς και εκδοροσφαγείς), ο προσδιορισμός του van γενότυπου αυτών, καθώς και η αξιολόγηση της πιθανής επιδημιολογικής τους συσχέτισης με κλινικά VRE στελέχη απομονωμένα από νοσηλευμένους ασθενείς από τις ίδιες γεωγραφικές περιοχές της Ελλάδας, και κατά την ίδια χρονική περίοδο.Συνολικά πεντακόσια (500) δείγματα τυφλού εντέρου κρεοπαραγωγών ορνιθίων συλλέχθηκαν σε δύο σφαγεία πουλερικών, που προέρχονταν από οκτώ (8) πτηνοτροφεία κρεοπαραγωγών ορνιθίων της Βόρειας Ελλάδας. Κατά την ίδια χρονική περίοδο, σε δύο σφαγεία ζώων, συλλέχθηκαν δείγματα περιεχομένου παχέος (τυφλού) εντέρου από εξήντα (60) μόσχους και διακόσια πενήντα (250) παχυνόμενους χοίρους. Οι μόσχοι προέρχονταν από επτά (7) εκτροφές της Βόρειας Ελλάδας, ενώ οι χοίροι από έξι (6) εκτροφές της Βόρειας και Κεντρικής Ελλάδας. Επιπλέον, κατά την ίδια χρονική περίοδο, 50 δείγματα κοπράνων συλλέχθηκαν από ισάριθμους πτηνοσφαγείς καθώς και 50 δείγματα κοπράνων από ισάριθμους εκδοροσφαγείς που εργάζονταν στα αντίστοιχα σφαγεία. Η απομόνωση VRE στελεχών επιχειρούνταν με εκλεκτικό προεμπλουτισμό σε υποστρώματα που περιείχαν βανκομυκίνη (6mg/l).Τέλος, εξετάστηκαν 63 ανθρώπινα κλινικά στελέχη VREF, που απομονώθηκαν την ίδια χρονική περίοδο, εκ των οποίων 48 προέρχονταν από δείγματα ενηλίκων (n=13) και νεογνών (n=35) από το Ιπποκράτειο Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο Θεσσαλονίκης και 15 προέρχονταν από δείγματα ενηλίκων ασθενών από το Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο Λάρισας.Για τον έλεγχο της αντοχής στη βανκομυκίνη και την τεϊκοπλανίνη όλα τα ύποπτα VRE στελέχη εξετάστηκαν με τη μέθοδο Kirby-Bauer. Επιπρόσθετα, υπολογίστηκε η ελάχιστη ανασταλτική συγκέντρωση (Minimum Inhibitory Concentration, MIC) αυτών με τη μέθοδο των διαδοχικών μικροαραιώσεων.Για την ανίχνευση των van γονιδίων αντοχής, όλα τα ύποπτα στελέχη με MIC βανκομυκίνης ≥ 2 μg/ml εξετάστηκαν με τη μέθοδο της πολλαπλής PCR (multiplex PCR). Οι αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση εκκινητών ειδικών για την ανίχνευση των γονίδιων vanA, vanB, vanC1-C2, vanD, vanE, vanG, ddl-E. faecium και ddl-E. faecalis. Συνολικά, 120 στελέχη VRE απομονώθηκαν από 112 (22,4%) δείγματα κρεοπαραγωγών ορνιθίων. Στελέχη VREF που έφεραν το γονίδιο vanA επικρατούσαν και ανακτήθηκαν από 74 (14,8%) δείγματα από 5 από τα 8 (62,5%) συνολικά πτηνοτροφεία, ενώ στελέχη E. gallinarum που έφεραν το γονίδιο vanC ανακτήθηκαν από 39 (7,8%) δείγματα επίσης από 5 πτηνοτροφεία. VRE απομονώθηκαν από 14 (28%) δείγματα πτηνοσφαγέων εκ των οποίων 10 (20%) ήταν θετικά σε VREF και 4 (8%) σε E. gallinarum. Επιπρόσθετα, ένα στέλεχος VREF απομονώθηκε από 1 (1,7%) δείγμα μόσχων που έφερε το γονίδιο vanA. Δεν απομονώθηκαν VRE από τα δείγματα κοπράνων των χοίρων καθώς και από τα δείγματα κοπράνων των εκδοροσφαγέων. Τα ποσοστά του επιπολασμού των VREF στελεχών των ορνιθίων, δείχνουν μια αξιοσημείωτη εμμονή στο περιβάλλον κρεοπαραγωγής των κρεοπαραγωγών ορνιθίων ακόμα και πάνω από μια δεκαετία από την κατάργηση της αβοπαρκίνης και χωρίς καμία εμφανή πίεση από τη χρήση άλλων γλυκοπεπτιδίων. Όλα τα VRE στελέχη, επιπρόσθετα του ελέγχου της αντοχής τους στη βανκομυκίνη και τεϊκοπλανίνη, εξετάστηκαν για τον καθορισμό της αντοχής που παρουσίαζαν σε 12 αντιμικροβιακές ουσίες. Τα VREF στελέχη των ορνιθίων παρουσίαζαν σταθερά αντοχή στην τετρακυκλίνη (100%). Αντίθετα, η συντριπτική πλειοψηφία των κλινικών VREF στελεχών παρουσίαζαν αντοχή στην αμπικιλλίνη (93,7%) και την πενικιλλίνη (93,7%). Ωστόσο, χαμηλά ποσοστά αντοχής στην τετρακυκλίνη (9,5%) και την αμπικιλλίνη (16,5%) παρατηρήθηκαν μεταξύ των κλινικών VREF και των VREF των ορνιθίων, αντίστοιχα. Τα στελέχη των πτηνοσφαγέων εμφάνισαν χαμηλά ποσοστά αντοχής στην αμπικιλλίνη (10%), ομοίως με των ορνιθίων. Επιπρόσθετα, εμφάνισαν μέτρια ποσοστά αντοχής στην τετρακυκλίνη (40%). Μία άλλη αντιμικροβιακή ουσία στην οποία τα VREF στελέχη των ορνιθίων και τα νοσοκομειακά εμφάνισαν υψηλά ποσοστά αντοχής, ήταν η ερυθρομυκίνη (54,4% και 57,1%, αντίστοιχα). Η ανάλυση των φαινοτύπων αντοχής των VREF στελεχών, ανέδειξε 53 διακριτούς τύπους, με μόνο 5 από αυτούς να μοιράζονται μεταξύ των στελεχών από τις διαφορετικές πηγές. Εν τω μεταξύ, το 54,4% των VREF στελεχών των ορνιθίων, το VREF στέλεχος των μόσχων και το 92,1% των κλινικών, ήταν πολυάντοχα, δηλ. παρουσίαζαν αντοχή σε ≥5 κλάσεις αντιμικροβιακών, ενώ αντίθετα μόνο το 10% των VREF στελεχών που απομονώθηκαν από τους πτηνοσφαγείς ήταν πολυάντοχο.Οι διαφορές στα ποσοστά της αντοχής στις διάφορες αντιμικροβιακές ουσίες σε συνδυασμό με την ύπαρξη διαφορετικών φαινοτύπων αντοχής μεταξύ των VREF από τις διαφορετικές πηγές (ορνίθια, μόσχοι, πτηνοσφαγείς, νοσηλευόμενοι ασθενείς) αντανακλούν το ευρύ (διαφορετικό) φάσμα της επιλεκτικής πίεσης που ασκείται από τη χρήση των αντιμικροβιακών ουσιών σε κάθε πηγή.Ο συσχετισμός των προφίλ της αντιμικροβιακής αντοχής μεταξύ των VREF στελεχών από τις πηγές που απομονώθηκαν, καθορίστηκε με τη χρήση της Διαχωριστικής Ανάλυσης (Discriminant analysis, DA), βασισμένη στο σύνολο των 14 αντιμικροβιακών ουσιών που χρησιμοποιήθηκαν για τον έλεγχο της ευαισθησίας. Όλα τα VREF στελέχη των κρεοπαραγωγών ορνιθίων και τα κλινικά ταξινομήθηκαν στην αντίστοιχη πηγή τους σε ποσοστό 100% και 85,7%, αντίστοιχα, δείχνοντας ένα σαφή διαχωρισμό και συσχετισμό με την πηγή προέλευσής τους. Αντίθετα, το ποσοστό ταξινόμησης των πτηνοσφαγέων στην πηγή τους ήταν μόλις 50%, δείχνοντας το χαμηλό συσχετισμό με την πηγή προέλευσής τους. Χαρακτηριστικό είναι ότι το 40% των στελεχών των πτηνοσφαγέων ταξινομήθηκαν κοντά στην πηγή των ορνιθίων, λόγω κοινών φαινοτύπων που μοιράζονταν με τα στελέχη των ορνιθίων.Για την γενετική-επιδημιολογική συσχέτιση των VREF στελεχών, επιλέχτηκε και εφαρμόστηκε η PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis) που παρουσιάζει μεγάλη ικανότητα διαφοροποίησης στελεχών. Η PFGE ανάλυση αποκάλυψε ηλεκτροφορητικά DNA πρότυπα, τα οποία συσχετίζονταν σαφώς με την πηγή τους. Εν τω μεταξύ, μια υψηλή γενετική ποικιλότητα παρατηρήθηκε μέσα σε κάθε πηγή (ορνίθια, πτηνοσφαγείς, νοσηλευόμενοι ασθενείς), όπως αποδεικνύεται από την ύπαρξη πολυάριθμων κλώνων. Συγκεκριμένα, τα 71 από τα 79 στελέχη των ορνιθίων ομαδοποιήθηκαν σε 4 κλωνικές ομάδες, C1-C4, ενώ τα 37, από τα 63 νοσοκομειακά στελέχη ομαδοποιήθηκαν επίσης σε 4 κλώνους, τους Η1 - Η4, εμφανίζοντας κάτω από 60% ομοιότητα με τους C κλώνους. Όλα τα υπόλοιπα στελέχη των ορνιθίων και τα νοσοκομειακά στελέχη, τα στελέχη των πτηνοσφαγέων καθώς και το στέλεχος VREF των μόσχων έδωσαν μεμονωμένους κλώνους μη συσχετιζόμενους μεταξύ τους ή με τους κλώνους C ή Η.Η σύγκριση των PFGE ηλεκτροφορητικών προτύπων έδειξε ότι τα VREF στελέχη των ορνιθίων και τα νοσοκομειακά VREF αποτελούν μη συσχετιζόμενους γενετικά πληθυσμούς, αναδεικνύοντας τη μη κλωνική διασπορά μεταξύ των δύο πηγών. Επιπρόσθετα, κανένας κοινός κλώνος μεταξύ VREF των ορνιθίων και VREF των πτηνοσφαγέων, παρά τους κοινούς φαινοτύπους όπως υποστηρίζεται από την DA, δεν αναδείχτηκε, που καταρχήν δείχνει τη μη κλωνική διασπορά μεταξύ των δυο πηγών. Ωστόσο, η ύπαρξη γενετικά αδιαφοροποίητων PFGE προτύπων στελεχών VREF ορνιθίων μεταξύ πτηνοτροφείων από διαφορετικές γεωγραφικά περιοχές, όπως επίσης και το γεγονός ότι οι H1 και H2 κλώνοι μοιράζονταν στελέχη με κοινούς φαινοτύπους αντοχής, από διαφορετικά νοσοκομεία, δείχνει ότι η κλωνική διασπορά φαίνεται να συμβαίνει μέσα στην ίδια πηγή.Οι παραπάνω πληροφορίες μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως βάση για να διευκρινιστεί περαιτέρω εάν «ειδικά» vanA γενετικοί καθοριστές κυκλοφορούν στο περιβάλλον των ορνιθίων ή στο περιβάλλον των ανθρώπων, όπως επίσης να διευκρινιστεί ο μηχανισμός της μακρόχρονης παρουσίας των VREF στην Ελλάδα.