Μελέτη επίδρασης βιοϋμενίων τροφιμογενών παθογόνων ως παραγόντων διασταυρούμενης μόλυνσης σε οικιακό περιβάλλον

Abstract

Quantification of common cross-contamination scenarios encountered in households and identification of the factors that may affect the transfer of foodborne bacteria through contact surfaces provides a scientific basis for risk management. The initial aim of this study was to investigate, through an online survey, Greek consumer’s attitudes, opinions and self-reported practices during food handling that may compromise food safety and lead to foodborne illnesses. In the meantime, the acknowledgment on behalf of the tested consumers of common foodborne pathogens and the prevalence of foodborne illness during the last 12 months was determined (CHAPTER 3). The educational level and employment status seemed to influence the acknowledgment of consumers concerning food safety, however gender, age and incidence of foodborne illness during the last 12 months had no impact. Although, according to the survey findings, the majority of consumers acknowledge the importance of personal hygiene, decontamitation of kitchen equipment, food preparation and prevention of cross contamination, a considerable proportion of the participants also admit the embracement of inappropriate food-handling practices. Given the above, the transfer potential of common foodborne pathogens (Salmonella enterica ser. Typhimurium, Escherichia. coli O157:H7 and Listeria monocytogenes) from contaminated raw meat through various surfaces (i.e. stainless steel, polyethylene and wooden) to other food of animal- or plant origin was assessed (CHAPTER 4). Results revealed that all the factors examined, i.e. the bacterial species, the size of initial inoculum, the contact time, the type of surface and the number of fillet influenced the degree of transfer of pathogens to subsequent fillets. All non-inoculated fillets were contaminated with a progressive reduction trend in pathogen population levels from the inoculated fillets to the sixth non-inoculated ones that got in contact with the surfaces, regardless of the initial inoculum. Wooden surfaces enhanced the transfer of bacteria to subsequent fillets compared with other materials after 15 min of contact. S. Typhimurium was transferred at lower rates to contaminated fillets than E. coli O157:H7, followed by L. monocytogenes.According to the consumers’ survey, various practices and attitudes towards washing of food contact surfaces have been recorded among different individuals and a considerable proportion of the participants admitted the use of common cutting boards for raw meat and fresh produce. Hence, taking into consideration the main factors that affect bacterial transfer, the objectives of the next study were to investigate S. Typhimurium cross-contamination from inoculated beef fillets to tomatoes through cutting boards and knives (i) without intermediate cleaning of kitchen equipment and (ii) under three decontamination scenarios that may be practiced in households: rinsing only with tap water, washing/scrubbing with detergent and using a commercial antibacterial product (CHAPTER 5). Data derived from this study revealed that rinsing only with tap water was not able to reduce the bacterial load to safe levels. On the other hand, thorough mechanical washing of surfaces with water and detergent turned out to be efficient in considerably reducing cross-contamination between raw meat and fresh produce, at least with regard to polyethylene and stainless steel surfaces. With particular reference to the surfaces’ materials, given their difficult decontamination and the potentially high transfer of pathogens to biotic surfaces, as illustrated by the results of this study, the use of wooden cutting boards should be avoided.Based on the aforementioned discussion, it is concluded that a significant factor associated with cross contamination events in the domestic environment is the remaining population of pathogenic cells on abiotic surfaces, following inadequate cleaning and disinfection procedures. During the processing of contaminated raw materials bacteria may deposit to surfaces and form multispecies biofilms. Biofilms are one of the major issues related to food safety concerns and once established, biofilms generally exhibit increased resistance to antimicrobials, thus creating the potential for reoccurring contamination events as outer layers of the biofilm slough off into the surrounding environment. In this study two strategic approaches were evaluated to confront biofilms: prevention and eradication. Materials that change surface properties is a way to prevent attachment and reduce the formation or enhance the dispersion of biofilm, while the use of disinfecting agents is a way to eradicate already formed biofilms. To this direction, the characterization of the biofilm formation of S. Typhimurium and S. aureus (3 strains each) was evaluated on stainless steel surfaces, under mono and dual-species conditions. In addition, the efficacy of 3 different chemical antimicrobial compounds (benzalkonium chloride, BC, peroxyacetic acid, PAA and sodium hypochlorite, NaClO) was investigated (CHAPTER 6). Results showed that dual-species conditions lead to a significant reduction in the number of sessile cells, compared to mono-species conditions. Regarding the disinfection resistance, in general BC was found to be more effective in both mono- and dual-species biofilm communities. BC was more effective against S. Typhimurium than S. aureus biofilm concerning monoculture conditions. The effectiveness of PAA was highly variated against S. aureus, in mixed-culture conditions with S. Typhimurium. Treatment with NaClO was not effective in eliminating both sessile communities under mono/dual cultures. The dominance of each strain in the sessile communities was monitored by PFGE that interestingly revealed different strain prevalence, regarding biofilm formation ability and antimicrobial resistance. Furthermore, nano-coatings based on organosilanes that enhance hydrophobicity of surfaces were tested against common foodborne bacteria (S. aureus, S. Typhimurium, L. monocytogenes, Y. enterocolitica, E. coli O157:H7) attachment and subsequent biofilm formation on stainless steel and glass surfaces (CHAPTER 7). Organosilane-based products seemed to affect bacterial attachment on the inert surfaces and/or subsequent biofilm formation, but it was highly dependent on the species and the surface material involved. According to our results, organosilanes eliminated the adherence (3 h) and bifilm formation (24 h) of S. Typhimurium both at modified glass and stainless steel surfaces. Significant higher cell population of S. aureus (glass) and E.coli O157:H7 (stainless steel) were attached on surfaces modified with organosilanes compared to controls. Organosilanes had no effect on eliminating L. monocytogenes attached cells nor biofilm formation.Overall, the present Thesis highlights the positive impact on food safety following consumers’ adoption and implementation of safe practices during food preparation and adequate subsequent cleaning/disinfection procedures. Bacterial transfer was also determined as a multi-factor process that was directly depended on many endogenous and exogenous factors and their interactions. Furthermore, an insight into multispecies/multistrains biofilm interactions, as an important factor during cross-contamination phenomena was obtained. Finally, the evaluation of efficacy of important strategies (disinfectants, nano- coatings) against bacterial attachment and biofilm formation was determined.

Η προσομοίωση και η ποσοτικοποίηση σε εργαστηριακό επίπεδο φαινομένων διασταυρούμενης επιμόλυνσης που συχνά παρατηρούνται σε οικιακό ή περιβάλλον βιομηχανίας τροφίμων με την παράλληλη αναγνώριση παραγόντων που έχουν επίδραση στη μεταφορά των τροφιμογενών παθογόνων αποτελούν την επιστημονική βάση για την ανάλυση της επικινδυνότητας. Ο αρχικός σκοπός αυτής της μελέτης ήταν η διερεύνηση μέσω διαδικτυακής μελέτης, των αντιλήψεων, των γνώσεων και των αυτό- αναφερόμενων πρακτικών των καταναλωτών στην Ελλάδα που μπορεί να υπονομεύσουν την ασφάλεια των τροφίμων και να οδηγήσουν σε τροφιμογενείς λοιμώξεις (ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3). Παράλληλα, προσδιορίστηκε η αναγνώριση κοινών τροφιμογενών παθογόνων από τους καταναλωτές και η συχνότητα καθώς επίσης και η πηγή τροφιμογενών λοιμώξεων κατά τους τελευταίους 12 μήνες. Οι γνώσεις ασφαλούς χειρισμού των τροφίμων επηρεάστηκαν κυρίως από το μορφωτικό επίπεδο και την επαγγελματική κατάσταση των καταναλωτών, ενώ δεν είχε επίδραση το φύλο, η ηλικία και η ύπαρξη τροφολοίμωξης τους τελευταίους 12 μήνες. Αν και σύμφωνα με τα αποτελέσματα της έρευνας η πλειοψηφία των καταναλωτών γνωρίζε τη σημασία της προσωπικής υγιεινής, του καθαρού οικιακού εξοπλισμού και της πρόληψης της διασταυρούμενης επιμόλυνσης κατά την διάρκεια προετοιμασίας γευμάτων, ωστόσο υπήρχε ποσοστό των ερωτηθέντων που υιοθετούσε λανθασμένες πρακτικές χειρισμού τροφίμων. Εν συνεχεία, ποσοστικοποιήθηκε η μεταφορά κοινών τροφιμογενών παθογόνων (S. Typhimurium, E. coli O157:H7 και Listeria monocytogenes) από τεχνητά επιμολυσμένο κρέας μέσω επιφανειών (ανοξείδωτος χάλυβας, πολυαιθυλένιο, ξύλο) σε μη επιμολυσμένο κρέας (ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4). Σύμφωνα με τα αποτελέσματα όλοι οι παράγοντες που εξετάστηκαν (δηλ. είδος βακτηρίου, μέγεθος ενοφθαλμίσματος, τύπος της επιφάνειας και αριθμός διαδοχικού φιλέτου) είχαν επίδραση στο επίπεδο μεταφοράς των παθογόνων στα διαδοχικά φιλέτα, εκτός από το χρόνο επαφής. Συγκεκριμένα, η μεταφορά στα επόμενα φιλέτα ήταν ανάλογη με το μέγεθος του ενοφθαλμίσματος, με φθίνουσα τάση από τα πρώτα στα τελευταία φιλέτα. Η επαφή με τις ξύλινες επιφάνειες οδήγησε σε υψηλότερη μεταφορά των παθογόνων στα επόμενα φιλέτα σε σχέση με το πολυαιθυλένιο και τον ανοξείδωτο χάλυβα. Όσον αφορά το είδος του παθογόνου, η S. Typhimurium φάνηκε να μεταφέρεται σε χαμηλότερο επίπεδο στα επόμενα φιλέτα σε σχέση με την L. monocytogenes, δηλαδή είχε την τάση να προσκολλάται καλύτερα στις επιφάνειες. Σύμφωνα με το ερωτηματολόγιο, διάφορες πρακτικές καταγράφηκαν όσον αφορά τον καθαρισμό των επιφανειών επεξεργασίας τροφίμων και σημαντικό ποσοστό των καταναλωτών ισχυρίστηκαν ότι χρησιμοποιούν κοινούς πάγκους κοπής για τρόφιμα ζωικής και φυτικής προέλευσης. Με αφορμή αυτή την παρατήρηση και με γνώμονα τους παράγοντες που φάνηκε να επηρεάζουν την μεταφορά των παθογόνων, ο σκοπός της επόμενης μελέτης ήταν η μελέτη της μεταφοράς S. Typhimurium από βόεια φιλέτα σε ντομάτες μέσω επαφής με επιφάνειες επεξεργασίας τροφίμων (ανοξείδωτος χάλυβας, πολυαιθυλένιο, ξύλο) και τεμαχισμού με μαχαίρι (ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5). Επιπροσθέτως εφαρμόστηκαν διαδικασίες καθαρισμού και απολύμανσης που εφαρμόζονται σε οικιακό επίπεδο με σκοπό να ελεγχθεί η αποτελεσματικότητα τους (π.χ. μόνο νερό, νερό και απορρυπαντικό πιάτων, απολυμαντικό σπρέι). Τα δεδομένα αυτής της μελέτης έδειξαν ότι το ξέπλυμα των επιφανειών μόνο με νερό δεν μείωσε τον πληθυσμό των βακτηρίων σε ασφαλή επίπεδα. Αντιθέτως, τόσο το πλύσιμο των επιφανειών με απορρυπαντικό πιάτων όσο κι η χρήση απολυμαντικού σπρέι ήταν αποτελεσματικοί μέθοδοι στην πρόληψη της διασταυρούμενης επιμόλυνσης μεταξύ κρέατος και λαχανικών, καθώς ο πληθυσμός των βακτηρίων στην πλαστική και την επιφάνεια του ανοξείδωτου χάλυβα ήταν κάτω του ορίου ανίχνευσης. Ωστόσο, το ίδιο δεν ισχύει για τη ξύλινη επιφάνεια, όπου δεδομένου της αδυναμίας επαρκούς καθαρισμού με όλες τις προαναφερόμενες μεθόδους, η χρήση τους θα πρέπει να αποφεύγεται. Συνεπώς, συμπεραίνεται από τα παραπάνω ότι ένας σημαντικός παράγοντας που σχετίζεται με τα γεγονότα διασταυρούμενης επιμόλυνσης είναι τα παθογόνα κύτταρα που παραμένουν στις αβιοτικές επιφάνειες ως αποτέλεσμα ανεπαρκών διαδικασιών καθαρισμού και απολύμανσης. Εξαιτίας της πιθανής επεξεργασίας επιμολυσμένων πρώτων υλών, τα βακτήρια εναποτίθενται στις επιφάνειες και σχηματίζουν μικτά βιοϋμένια που αποτελούνται από διάφορα γένη, είδη ή και στελέχη μικροοργανισμών. Τα βιοϋμένια είναι ζωτικής σημασίας για την ασφάλεια των τροφίμων κι αφού εγκατασταθούν σε μια επιφάνεια πιθανόν να επιδεικνύουν αυξημένη ανθεκτικότητα στα αντιβιοτικά και στα απολυμαντικά προκαλώντας επανειλημμένα επεισόδια διασταυρούμενης επιμόλυνσης μέσω αποκόλλησης κυττάρων από τα εξωτερικά στρώματα του βιοϋμενίου. Σε αυτή τη μελέτη δυο στρατηγικές ελέγχου των βιοϋμενίων που βασίζονται στην πρόληψη σχηματισμού ή στην καταπολέμηση του ώριμου βιοϋμενίου, ελέγχθηκαν ως προς την αποτελεσματικότητά τους. Προς αυτή την κατεύθυνση προσδιορίστηκε ο σχηματισμός βιοϋμενίου S. Typhimurium και S. aureus (3 στελέχη έκαστο), υπό συνθήκες μονοκαλλιέργειας ή μικτής καλλιέργειας και η αποτελεσματικότητα 3 διαφορετικών απολυμαντικών (χλωριούχο βενζαλκόνιο, υπεροξικό οξύ, υποχλωριώδες νάτριο). Ο ανοξείδωτος χάλυβας όπου διενεργήθηκαν τα πειράματα και τα προαναφερόμενα απολυμαντικά χρησιμοποιούνται ευρέως σε επιφάνειες επεξεργασίας τροφίμων σε βιομηχανίες και χώρους μαζικής εστίασης (ΚΕΦΑΛΑΙΟ 6). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι υπό συνθήκες μικτής καλλιέργειας παρατηρήθηκε σημαντική μείωση στο πληθυσμό και των δυο βακτηρίων σε σχέση με την μονοκαλλιέργεια (P < 0,05). Το χλωριούχο βενζαλκόνιο (50 ppm) ήταν το πιο αποτελεσματικό απολυμαντικό στη καταπολέμηση του βιοϋμενίου ανεξαρτήτως του είδους της καλλιέργειας. Το χλωριούχο βενζαλκόνιο ήταν πιο αποτελεσματικό έναντι της S. Typhimurium σε σχέση με τον S. aureus, στις μονοκαλλιέργειες. Το υπεροξικό οξύ (10 ppm) παρουσίασε μεγαλύτερη διακύμανση της αποτελεσματικότητάς του έναντι του S. aureus, παρουσία της S. Typhimurium. Ενώ τόσο το βιοϋμένιο της S. Typhimurium, όσο και του S. aureus παρουσίασαν ανθεκτικότητα στο υποχλωριώδες νάτριο (10 ppm). Η επικράτηση του κάθε στελέχους όσον αφορά το σχηματισμό βιοϋμενίου πριν και μετά την εφαρμογή του απολυμαντικού ελέγχθηκε με τη μέθοδο της ηλεκτροφόρησης εναλλασσόμενου ηλεκτρικού πεδίου, η οποία ανέδειξε διαφορές στη συχνότητα εμφάνισης του κάθε στελέχους. Επιπρόσθετα, διερευνήθηκε η πρόληψη της βακτηριακής προσκόλλησης και του σχηματισμού βιοϋμενίου μέσω της τροποποίησης των ιδιοτήτων της επιφάνειας. Για το σκοπό αυτό νανοεπιστρώσεις με βάση τις οργανοσιλάνες (ενώσεις διοξειδίου του πυριτίου/ SiO2) που ενισχύουν την υδροφοβικότητα των επιφανειών ελέγχθηκαν έναντι στην προσκόλληση και τον σχηματισμό βιοϋμενίου παθογόνων (S. aureus, S. Typhimurium, L. monocytogenes, Y. enterocolitica, E. coli O157:H7) σε επιφάνειες ανοξείδωτου χάλυβα και γυάλινες (2 προϊόντα σε κάθε υλικό) (ΚΕΦΑΛΑΙΟ 7). Οι νανοεπιστρώσεις φάνηκαν να έχουν επίδραση στην βακτηριακή προσκόλληση ή/ και στον πληθυσμό του ώριμου βιοϋμενίου, ωστόσο η αποτελεσματικότητά τους εξαρτώταν άμεσα από το είδος των βακτηρίων και το υλικό των επιφανειών που χρησιμοποιήθηκαν. Για παράδειγμα, οι οργανοσιλάνες φάνηκε να επηρεάζουν την προσκόλληση και το σχηματισμό βιουμενίου (24 h) της S. Typhimurium τόσο στον ανοξείδωτο χάλυβα, όσο και στις γυάλινες επιφάνειες. Ωστόσο, παρατηρήθηκε αύξηση στην προσκόλληση των κυττάρων του S. aureus στο γυαλί και της E. coli O157:H7 στον ανοξείδωτο χάλυβα, ενώ οι οργανοσιλάνες δεν είχαν καμία επίδραση ως προς την προσκόλληση και το σχηματισμό του βιοϋμενίου της L. monocytogenes ανεξαρτήτως χρόνου και υλικού επιφανείας. Συμπερασματικά, η παρούσα διδακτορική διατριβή υπογραμμίζει τη θετική επίπτωση στην ασφάλεια τροφίμων και κατά συνέπεια στη μείωση των τροφολοιμώξεων που μπορεί να έχει η υιοθέτηση και η εφαρμογή, από μέρους των καταναλωτών, ασφαλών πρακτικών χειρισμού τροφίμων και επαρκών διαδικασιών καθαρισμού/ απολύμανσης. Επιπροσθέτως, διερευνήθηκε η βακτηριακή μεταφορά μεταζύ τροφίμων ζωικής προέλευσης ή ζωικής-φυτικής προέλευσης και αποδείχθηκε ότι αποτελεί μια πολυπαραγοντική διαδικασία που εξαρτάται από πολλούς παράγοντες και τις αλληλεπιδράσεις τους. Επιπλέον, μελετήθηκε η αλληλεπίδραση μεταξύ ειδών και στελεχών βακτηρίων σε μικτά βιοϋμένια που πιθανόν να ανευρίσκονται σε χώρους επεξεργασίας τροφίμων, ως σημαντικός παράγοντας κατά τη διασταυρούμενη επιμόλυνση. Τέλος, εκτιμήθηκε η αποτελεσματικότητα απολυμαντικών και νανοεπιστρώσεων ως κύριες στρατηγικές πρόληψης και καταπολέμησης των βιοϋμενίων παθογόνων μικροοργανισμών.