Σχέσεις δομής - λειτουργίας και εξέλιξης στους μεταφορείς πουρινών της οικογένειας NAT/NCS2

Abstract

The objective of this work was to study the structure-function and specificity relationships of the NAT/NCS2 purine transporter family. The aim of the present work was a) to characterize functionally new NAT/NCS2 homologs from Escherichia coli K-12 and Sinorhizobium meliloti 1021 and b) compare closed related transporters but with distinct functional profiles with mutagenesis with already known related homologs to reveal the major specificity determinants in each cluster of the family or in general. The new NAT/NCS2 homologs analyzed for their functional profile in the current thesis include RutG (COG2233) and PurP, YicO, YjcD and YgfQ (COG2252) from Escherichia coli and SmLL9, SmLL8, SmX28 (COG2233), SmVC3 and SmYE1 (COG2252) from the nitrogen-fixing rhizobium Sinorhizobium meliloti. On S.meliloti additional findings are presented which contribute to the understanding of the potential physiological role of one of the transporters studied (SmLL9) in symbiotic nitrogen fixation. It was also found that the xanthine and uric acid transporter SmLL9 is responsible for the xanthine uptake in laboratory cultures of S. meliloti growth on xanthine as a sole nitrogen source, indicating that a similar important role may be present in the symbiotic nodules formed by S. meliloti in legume roots. Mutagenesis studies revealed important for function residues in all NAT/NCS2 homologs tested. E241 (TM8) and E290 (TM10) (numbered based on UraA) are irreplaceable are irreplaceable for function of the NAT/NCS2 transporters, probably because they are involved directly to the binding of substrate (uracil) through hydrogen bonds. A very important role is probably played by Asp/His-245 (TM8). This position of TM8 has been studied more extensively in the xanthine and xanthine/uric acid transporters of COG2233 which retain an Asp at this position (D276 in XanQ, very important as a carbocyl group for retention of high-level activity). Based on the analysis of the pH profiles of XanQ and relevant mutant, it may be proposed that this Asp residue affects the protonation-deprotonation of the substrate-binding Ε241 (ΤΜ8) (Ε272 in XanQ) and, thus, indirectly affects the substrate binding and/or the proton symport mechanism. The site Ser/Thr/Asn-93 at TM3 appears to be important for the distinction between uric acid and xanthine substrates in the group of purine transporters of COG2233. A possible explanation is that this polar group participates in a hydrogen bond network involving also the substrate-binding E262/272 (TM8) and the amino acid changes at this position of ΤΜ3 affect the binding interaction of E262/272. Of the pyrimidine transporters, the Phe-73/Ala-88 is decisive for the broader specificity because the phenyl group of F73 does not allow the appropriate orientation of thymine in the binding site due to steric hindrance from the methyl group at C5 of the pyrimidine ring. From the mutagenesis of rSNBT1, the results indicated that key for the distinction between pyrimidines and purines could be the polar group at E397 (TM10). The results of this PhD thesis offer important experimental evidence for the understanding of structure-function relationships in the NAT/NCS2 family of transporters and the interpretation of substrate specificity differences. In addition, the results on the purine transporters of S.meliloti offer a basis for understanding the physiological role of purine transporters in plant-bacterial symbioses and putative applications for improvement of crops in certain types of symbiotic nitrogen fixation.

Στην παρούσα Διατριβή μελετήθηκαν οι σχέσεις δομής-λειτουργίας και εξέλιξης στους μεταφορείς πουρινών της οικογένειας NAT/NCS2 και ειδικότερα στόχοι της εργασίας αυτής ήταν α) ο λειτουργικός χαρακτηρισμός νέων ομολόγων της οικογένειας από την Escherichia coli K-12 και το Sinorhizobium meliloti 1021 και β) η μελέτη με στοχευμένη μεταλλαξιγένεση σε ζεύγη κοντινών ομολόγων με διακριτές εξειδικεύσεις του ρόλου των καταλοίπων στο προβλεπόμενο κέντρο δέσμευσης και η εύρεση καθοριστών εξειδίκευσης στην περιοχή αυτή. Τα ομόλογα NAT/NCS2 που μελετήθηκαν είναι τα RutG (COG2233) και PurP, YicO, YjcD και YgfQ (COG2252) από την Escherichia coli και SmLL9, SmLL8, SmX28 (COG2233), SmVC3 και SmYE1 (COG2252) από το αζωτοδεσμευτικό ριζοβακτήριο Sinorhizobium meliloti. Ιδιαίτερα για το S.meliloti παρουσιάζονται δεδομένα που συνεισφέρουν στην κατανόηση του πιθανού φυσιολογικού ρόλου ενός από τα ομόλογα που μελετήθηκαν (SmLL9) στην συμβιωτική αζωτοδέσμευση. Για τον μεταφορέα ξανθίνης και ουρικού οξέος SmLL9 βρέθηκε ότι είναι υπεύθυνος για την πρόσληψη της ξανθίνης σε εργαστηριακές καλλιέργειες κυττάρων του S.meliloti που αυξάνονται με ξανθίνη ως πηγή αζώτου, μια παρατήρηση που υποδεικνύει ότι μπορεί να έχει ανάλογο σημαντικό ρόλο και στα συμβιωτικά φυμάτια που σχηματίζει ο S.meliloti στις ρίζες των ψυχανθών. Η μελέτη με στοχευμένη μεταλλαξιγένεση έδειξε ότι υπάρχουν θέσεις πολύ σημαντικές για την λειτουργία όλων των μεταφορέων της οικογένειας ανεξάρτητα από την εξειδίκευσή τους και συγκεκριμένα οι θέσεις E241 (TM8) και E290 (TM10) (αρίθμηση σύμφωνα με τον UraA) που συμμετέχουν άμεσα στην πρόσδεση του υποστρώματος (ουρακίλης) με δεσμούς υδρογόνου, είναι αναντικατάστατα σε όλη την οικογένεια NAT/NCS2. Πολύ σημαντικό ρόλο έχει η Asp/His-245 (TM8) για την οποία στους μεταφορείς ξανθίνης ή ξανθίνης/ουρικού όπου συντηρείται ως Asp (D276 στον XanQ, απαραίτητη η καρβοξυλομάδα για υψηλή ενεργότητα) παρουσιάσθηκαν ενδείξεις (από την ανάλυση της εξάρτησης της ενεργότητας από το pH) ότι ίσως επηρεάζει την πρωτονίωση-αποπρωτονίωση της καρβοξυλομάδας Ε241 (ΤΜ8) (Ε272 στον XanQ) επιδρώντας έμμεσα στη δέσμευση και/ή συμμεταφορά του πρωτονίου με το υπόστρωμα. Στο προβλεπόμενο κέντρο δέσμευσης βρέθηκαν θέσεις που καθορίζουν την εξειδίκευση των μεταφορέων συγκεκριμένων κλάδων και εξειδικεύσεων της οικογένειας. Στους μεταφορείς ξανθίνης ή/και ουρικού οξέος (COG2233) σημαντικό ρόλο στην εξειδίκευση έχει η θέση Ser/Thr/Asn-93 του TM3, η οποία συμμετέχει σε ένα δίκτυο δεσμών υδρογόνου που περιλαμβάνει και τη θέση E262/272 (TM8) που αλληλεπιδρά άμεσα με το υπόστρωμα στην ιμιδαζολική πλευρά και αλλαγές στη θέση του ΤΜ3 επηρεάζουν καταλυτικά αυτήν την αλληλεπίδραση. Στους μεταφορείς πυριμιδινων καθοριστική για την ευρύτερη εξειδίκευση του RutG μπορεί να είναι η Phe-73/Ala-88. Πιθανώς η φαινυλαλανίνη στη θέση F73 εμποδίζει την κατάλληλη διευθέτηση της θυμίνης στο κέντρο δέσμευσης λόγω στερεοχημικής παρεμπόδισης με την μεθυλομάδα στη θέση C5 του πυριμιδινικού δακτυλίου. Από την μεταλλαξιγένεση του rSNBT1, τα αποτελέσματα υπέδειξαν ότι καθοριστική για τη διάκριση ή μη μεταξύ πυριμιδινών και πουρινών στο κέντρο δέσμευσης μπορεί να είναι η θέση E397 (TM10) ενώ στην ομάδα COG2252 καθοριστές εξειδίκευσης στην περιοχή του προβλεπόμενου κέντρου δέσμευσης δεν βρέθηκαν. Από τα αποτελέσματά μας προκύπτουν σημαντικά στοιχεία για την πληρέστερη κατανόηση των σχέσεων δομής-λειτουργίας στην οικογένεια NAT/NCS2 και για την ερμηνεία των διαφορών εξειδίκευσης. Επίσης, η εργασία για τους μεταφορείς πουρινών του S.meliloti αποτελεί μια αρχική πειραματική βάση για να αναλυθεί περαιτέρω ο φυσιολογικός τους ρόλος στις συμβιωτικές σχέσεις βακτηρίων-φυτών.