Διερεύνηση του μηχανισμού πρόσληψης πουρινών στους μεταφορείς νουκλεοτιδικών βάσεων-ασκορβικού (NAT)

Abstract

The NAT family is an evolutionarily wide family (<1000 members) including microbial transporters recognizing as substrates purines, pyrimidines and several purine-based drugs and analogues as well as mammalian and human transporters specialized for the uptake of L-ascorbic acid. Using Cys-scanning mutagenesis in the environment of the Cys-less XanQ permease, we studied the role of the putative TM12 of XanQ and revealed the important role of Ile-432 in the approximate middle of TM12. At this position a side chain with specific volume and orientation is required for high-affinity transport. Alkylation of single-Cys mutants by N-ethylmaleimide showed that N430C is highly sensitive to inactivation, with IC50 10 μM, and is completely protected against inactivation in the presence of 2-thioxanthine, a high-affinity substrate analogue. The findings suggest that Asn-430 is probably at the vicinity of the binding site while Ile-432 may have an indirect effect on purine binding. Furthermore, we functionally characterized 7 new transporter homologs, from E. coli, from Sinorhizobium meliloti SM1021, and from extremophilic microorganisms, Moorella thermoacetica and Psychrobacter cryohalolentis K5. Of the newly characterized transporters, YgfU from E. coli is a low-affinity and high-capacity uric acid transporter (Km 0.5 ± 0.1 mM, Vmax 715 ± 81 nmol.mg-1.min-1) being the first such transporter found in enterobacteria. The other E. coli transporter, RutG, is a low-affinity xanthine transporter (Km 0.15 ± 0.02 mM) and does not appear to function as a uracil transporter which was previously postulated. Importantly, the newly characterized homolog LL9 is a high-affinity xanthine transporter (Km 7.3 ± 3.0 μM, Vmax 19.8 ± 3.2 nmol.mg-1.min-1) and low-affinity but high-capacity urate transporter (Km 0.9 ± 0.3 mM, Vmax 447 ± 37 nmol.mg-1.min-1) with broad specificity for recognition of purine analogues. This is the first nucleobase transporter found in rhizobia. Finally, our study included site-directed mutagenesis of the newly characterized uric acid transporter YgfU and reverse mutagenesis in XanQ. A major finding from this study is the importance of position Thr-100 (Asn-93 in XanQ) at the middle of TM3 for the selectivity preference between uric acid and xanthine, since small amino acid replacements in both XanQ and YgfU lead to the ability for uptake of both substrates.

Η οικογένεια ΝΑΤ είναι η εξελικτικά ευρύτερη οικογένεια μεταφορέων νουκλεοτιδικών βάσεων (πάνω από 1000 μέλη) και περιλαμβάνει μεταφορείς μικροοργανισμών που αναγνωρίζουν ως υποστρώματα πουρίνες, πυριμιδίνες και κυτταροτοξικά τους ανάλογα που χρησιμοποιούνται ως φάρμακα, αλλά και μεταφορείς του ανθρώπου και άλλων θηλαστικών που είναι εξειδικευμένοι για το L-ασκορβικό οξύ (βιταμίνη C). Η μελέτη του ρόλου της έλικας ΤΜ12 του μεταφορέα XanQ από την E. coli με μεταλλαξιγένεση κυστεϊνικής σάρωσης, ανέδειξε ως σημαντικό το Ile-432 στο μέσο της πιθανής έλικας, στην οποία θέση είναι απαραίτητο ένα κατάλοιπο με πλευρική αλυσίδα συγκεκριμένου μεγέθους και προσανατολισμού για την σωστή πρόσδεση ή μεταφορά του υποστρώματος. Η επίδραση του N-αιθυλμηλεϊμιδίου (NEM) στα μεταλλάγματα μοναδικής κυστεΐνης έδειξε ότι το μετάλλαγμα N430C είναι πολύ ευαίσθητο στην απενεργοποίηση από το ΝΕΜ (IC50 10μΜ), και ότι η παρουσία ενός μη-μεταφερόμενου υψηλής συγγένειας αναλόγου ξανθίνης, της 2-θειοξανθίνης, προστατεύει απόλυτα από την επίδραση αυτή. Οι παρατηρήσεις αυτές οδηγούν στο συμπέρασμα ότι το Asn-430 βρίσκεται κοντά στο κέντρο δέσμευσης του υποστρώματος ενώ η Ile-432, που υπόκειται σε στερεοχημικούς κυρίως περιορισμούς, επιδρά πιθανόν έμμεσα στη δέσμευση των πουρινών. Επίσης, χαρακτηρίστηκαν λειτουργικά 7 νέοι μεταφορείς ΝΑΤ, από την E. coli, από το ριζόβιο αζωτοδεσμευτικό βακτήριο Sinorhizobium meliloti, και από ακραιόφιλους οργανισμούς, από το ψυχρόφιλο Psychrobacter cryohalolentis και από το θερμόφιλο κλοστρίδιο Moorella thermoacetica. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον έχει ο YgfU από την E. coli, ένας μεταφορέας ουρικού οξέος χαμηλής συγγένειας (Km 0.5 ± 0.1 mM) και υψηλής ικανότητας μεταφοράς (Vmax 715 ± 81 nmol.mg-1.min-1), ο οποίος αποτελεί τον πρώτο μεταφορέα ουρικού που προσδιορίζεται σε ένα εντεροβακτήριο. Ο μεταφορέας RutG της E. coli είναι μεταφορέας ξανθίνης χαμηλής συγγένειας (Km 0.15 ± 0.02 mM) και δεν φαίνεται να είναι μεταφορέας ουρακίλης όπως έχει προταθεί στη βιβλιογραφία. Πολύ σημαντικός ήταν ο χαρακτηρισμός του μεταφορέα Q92LL9 (LL9), από το Sinorhizobium meliloti SM1021, ο οποίος βρέθηκε ότι είναι μεταφορέας ξανθίνης υψηλής συγγένειας (Km 7.3 ± 3 μΜ, Vmax 19.8 ± 3.2 nmol.mg-1.min-1) και μεταφορέας ουρικού χαμηλής συγγένειας (Km 0.9 ± 0.3 mΜ) και υψηλής απόδοσης (Vmax 447 ± 37 nmol.mg-1.min-1) και ότι έχει ευρεία εξειδίκευση για αναγνώριση αναλόγων πουρινών. Είναι ο πρώτος μεταφορέας νουκλεοτιδικών βάσεων που αναγνωρίζεται για ένα συμβιωτικό ριζοβακτήριο. Τέλος, από τη στοχευμένη μεταλλαξιγένεση του μεταφορέα ουρικού YgfU και εισαγωγή των «αντίστροφων» αντικαταστάσεων στις αντίστοιχες θέσεις του XanQ, πήραμε στοιχεία που αναδεικνύουν κυρίως το ρόλο της Thr-100 (Asn-93 στον XanQ), στο μέσο της έλικας ΤΜ3, για τον καθορισμό της επιλογής υποστρώματος μεταξύ ουρικού/ξανθίνης.