Ιn vitro μελέτη της ικανότητας διαφοροποίησης των μεγάλων μονοπυρήνων του περιφερικού αίματος προς κύτταρα που παράγουν ινσουλίνη

Abstract

Introduction. Recent studies provide evidence that peripheral blood monocytes have the ability to differentiate to mesenchymal-like cells. The aim of the present study is to analyse the ability of cultured monocytes to de-differentiate and produce insulin in vitro using growth factors or not and a long acting analog of Glucagon-Like-Peptide-1. The effect of a long acting analog of Glucagon-Like-Peptide-1 to monocyte differentiation was studied for the first time. (2)Methods Peripheral blood monocytes were isolated from healthy donors and cultivated for fourteen days. Growth factors and liraglutide were used to induce pancreatic differentiation in most of the cultures. The growth factors were: monocyte colony-stimulating factor, interleukin-3, hepatocyte growth factor and epidermal growth factor. The rest of the cultures were cultivated only with nutrient medium RPMI and human serum. Insulin levels were measured with an enzyme-linked immunosorbent assay. Measurements took place at the beginning of the cultures, on the seventh day and on the fourteenth day. Cellular morphology was observed using optical and electron microscopy. Cells were stained with May Grunwald-Giemsa dye. Cell membrane receptors were detected by flow cytometry. Statistical analysis was performed using parametric and non parametric statistical tests, depending on the normality of the distribution of the samples. (3)Results Monocytes were able to synthesize and excrete high levels of insulin after seven days in culture. Α further increase in the excretion of insulin was observed after fourteen days. Cells were also able to de-differentiate and synthesize insulin, even if no growth factors and liraglutide were added in the culture medium. The production of insulin is not statistically different between the cultures cultivated in the presence of growth factors and liraglutide and the cultures cultivated in the absence of growth factors. Differentiated monocytes were connected to neighbouring cells with axons. The morphology of the whole resembled the morphology of mesenchymal, dendritic and myeloid-progenitor cells. Cells retained their mature receptors (CD14, CD45, CD16) and simultaneously developed progenitor receptors on their membrane. (4)Conclusion Monocytes can acquire morphological properties of multipotent cells, when they are cultivated under specific conditions in vitro. Differentiated monocytes are able to synthesize and excrete insulin in large amount. It is noteworthy the cells that were cultured in the absence of growth factors steadily excreted insulin in a glucose-dependent manner. Additionally, the organization of cells with the cellular connections in the bottom of the well is impressive. Mesenchymal cells in the bone marrow form equivalent pictures in vivo. Insuliln-producing cells have probably clinical importance, as they can theoretically be used as graft for pancreatic tissue replacement therapies.

Εισαγωγή. Σε πρόσφατες έρευνες έχει παρατηρηθεί η ικανότητα των μονοκυττάρων του περιφερικού αίματος να διαφοροποιούνται προς κύτταρα με παρόμοια μορφολογία με τα μεσεγχυματικά κύτταρα. Σκοπός της μελέτης είναι να ερευνηθεί η ικανότητα των μονοκυττάρων για διαφοροποίηση και παραγωγή ινσουλίνης in vitro μετά από τη χορήγηση ή μη αυξητικών παραγόντων και αναλόγου του Παρόμοιου-με-Γλουκαγόνο Πεπτιδίου-1. Η επίδραση του αναλόγου του παρόμοιου-με-γλυκαγόνη πεπτιδίου-1 στη διαφοροποίηση των μονοκυττάρων μελετάται για πρώτη φορά. (2)Μέθοδοι Μονοκύτταρα του περιφερικού αίματος απομονώθηκαν από υγιείς δότες και καλλιεργήθηκαν για δεκατέσσερις ημέρες. Στις περισσότερες καλλιέργειες χρησιμοποιήθηκαν αυξητικοί παράγοντες και λιραγλουτίδη για να επαγάγουν τη διαφοροποίηση προς παγκρεατικά κύτταρα. Οι αυξητικοί παράγοντες είναι: ο αυξητικός παράγοντας των μονοκυττάρων, η ιντερλευκίνη 3, ο αυξητικός παράγοντας των ηπατοκυττάρων και ο αυξητικός παράγοντας των επιδερμικών κυττάρων. Οι υπόλοιπες καλλιέργειες έγιναν μόνο με τη χρήση θρεπτικού υλικού RPMI (Roswell Park Memorial Institute culture medium) και ανθρώπινου ορού αίματος. Τα επίπεδα ινσουλίνης μετρήθηκαν με τη μέθοδο του ενζυμικού ανοσοφθορισμού. Οι μετρήσεις έγιναν στην έναρξη των καλλιεργειών, στις επτά και στις δεκατέσσερις ημέρες. Η κυτταρική μορφολογία παρατηρήθηκε με το οπτικό και το ηλεκτρονικό μικροσκόπιο. Έγινε ιστολογική χρώση των κυττάρων με May Grunwald-Giemsa χρώση. Οι υποδοχείς της κυτταρικής μεμβράνης ανιχνεύθηκαν με κυτταρομετρία ροής στις επτά και δεκατέσσερις ημέρες καλλιέργειας. Η στατιστική ανάλυση έγινε με παραμετρικές και μη παραμετρικές δοκιμασίες, ανάλογα αν τα δείγματα ακολουθούν την κανονική κατανομή ή όχι. (3)Αποτελέσματα Τα μονοκύτταρα ήταν ικανά να παράγουν και να εκκρίνουν υψηλά επίπεδα ινσουλίνης ύστερα από επτά ημέρες σε καλλιέργεια. Περαιτέρω αύξηση της έκκρισης ινσουλίνης παρατηρήθηκε έπειτα από δεκατέσσερις ημέρες σε καλλιέργεια. Τα κύτταρα ήταν ικανά να διαφοροποιούνται και να συνθέτουν ινσουλίνη, ακόμη και όταν δεν είχαν προστεθεί αυξητικοί παράγοντες στο καλλιεργητικό υλικό. Η παραγωγή ινσουλίνης δεν διαφέρει στατιστικώς σημαντικά μεταξύ των καλλιεργειών που καλλιεργήθηκαν παρουσία αυξητικών παραγόντων-λιραγλουτίδης και των καλλιεργειών που καλλιεργήθηκαν απουσία αυξητικών παραγόντων. Τα διαφοροποιημένα μονοκύτταρα συνδέονταν με τα γειτονικά τους με αποφυάδες. Η μορφολογία του συνόλου των κυττάρων έμοιαζε με τα μεσεγχυματικά, τα δενδριτικά και τα προγονικά κύτταρα της μυελοειδούς σειράς. Τα κύτταρα διατήρησαν τους ώριμους υποδοχείς (CD14, CD45, CD16) στη βασική μεμβράνη τους και παράλληλα ανέπτυξαν προγονικούς υποδοχείς στην κυτταρική τους μεμβράνη (CD33, CD34, CD209).(4)Συμπεράσματα Τα μονοκύτταρα μπορούν να αποκτήσουν μορφολογικά χαρακτηριστικά των πολυδύναμων κυττάρων, όταν καλλιεργηθούν κάτω από συγκεκριμένες συνθήκες in vitro. Η μελέτη μας έδειξε για πρώτη φορά ότι τα διαφοροποιημένα μονοκύτταρα μπορούν να συνθέσουν και να εκκρίνουν ινσουλίνη σε μεγάλη ποσότητα. Είναι αξιοσημείωτο ότι τα κύτταρα που καλλιεργήθηκαν χωρίς αυξητικούς παράγοντες και λιραγλουτίδη, σταθερά έκκριναν ινσουλίνη με γλυκοζο-εξαρτώμενο τρόπο. Επίσης είναι εντυπωσιακή η οργάνωση των κυττάρων με τις κυτταρικές συνδέσεις στον πυθμένα των καλλιεργητικών τρυβλίων. Αντίστοιχες εικόνες in vivo σχηματίζουν τα μεσεγχυματικά κύτταρα στον μυελό των οστών. Τα ινσουλινοπαραγωγά κύτταρα παρουσιάζουν ενδεχομένως κλινική χρησιμότητα, αφού μπορούν θεωρητικά να χρησιμοποιηθούν ως μόσχευμα σε θεραπείες αναπλήρωσης των νησιδίων του παγκρέατος.