Αντοχή στελεχών γρίπης στους αναστολείς της νευραμινιδάσης και τις αμανταδάνες τη χρονική περίοδο 2005 - 2012 στην Ελλάδα: σχέση με υπότυπο γρίπης: επίδραση αντοχής στη λοιμογόνο ικανότητα των στελεχών

Abstract

The incidence of increased adamantane resistance among influenza A(H3N2) viruses isolated worldwide since 2003, the WHO recommendation (2005) for national measure of oseltamivir stockpile before pandemics and the increased numbers of severe and fatal influenza cases during the post-pandemic period in Greece necessitated investigation of influenza antiviral drug resistance. From 2005 to 2012, more than 300 influenza type Α viruses including A(H1N1), A(H1N1)pdm09, A(H3N2) and 100 type B viruses were included for susceptibility studies to adamantanes and the neuraminidase inhibitors oseltamivir and zanamivir. Antiviral resistance was assessed by neuraminidase and matrix sequence analysis - as well as the fluorescence-based 50% inhibitory concentration (IC50) method. Only five influenza A(H1N1)pdm09 viruses (1,5%) exhibited highly reduced inhibition by oseltamivir, all isolated from immunocompromised patients. Zanamivir susceptibility was not affected. In all 5 cases, the H275Y oseltamivir resistance-conferring neuraminidase substitution emerged after oseltamivir treatment. No influenza A(H3N2) and B viruses with altered susceptibility to oseltamivir or zanamivir were detected. Based on phylogenetic analysis, oseltamivir-resistant viruses did not form a separate cluster. A pattern of permissive neuraminidase mutations was unearthed in both oseltamivir-resistant and -susceptible viruses in post-pandemic seasons. Several amino acid substitutions in the HA1 domain of the haemagglutinin gene of both post-pandemic A(H1N1)pdm09 as well as A(H3N2) influenza viruses were discovered. The emergence of S31N aa associated with adamantanes resistance was detected in all influenza A viruses studied since 2008. The emergence of antiviral resistance in immunocompromised patients and the relation of neuraminidase and haemagglutinin mutations underline the need for efficient infection control and evolutionary analysis of the virus, respectively.

Η αυξημένη συχνότητα εμφάνισης ανθεκτικών ιών Α(Η3Ν2) στις αμανταδάνες από το 2003, η οδηγία του Π.Ο.Υ. (2005) για εθνικό σχέδιο αποθέματος οσελταμιβίρης σε περίπτωση πανδημίας και η αυξημένη βαρύτητα των περιστατικών Α(Η1Ν1)pdm09 γρίπης στην Ελλάδα κατά τη μετα-πανδημική περίοδο (2010-11) συγκριτικά με την πανδημία του 2009, κατέστησαν αναγκαία τη διερεύνηση πιθανής αντοχής ιών γρίπης έναντι των αναστολέων νευραμινιδάσης οσελταμιβίρη και ζαναμιβίρη και τις αμανταδάνες. Από το 2005 έως και το 2012, για 330 στελέχη γρίπης τύπου Α [A(H1N1), A(H1N1)pdm09, A(H3N2)] και 134 γρίπης τύπου Β, στο υπερκείμενο κυτταροκαλλιέργειας, εξετάστηκε η αναστολή του ενζύμου της νευραμινιδάσης ως η συγκέντρωση (αραίωση) οσελταμιβίρης ή ζαναμιβίρης που προκαλεί μείωση της ενεργότητας του ενζύμου κατά 50%. Παράλληλα, εφαρμόστηκε γενετική αλληλούχιση του γονιδίου της νευραμινιδάσης και της μητρικής (Μ2) πρωτεΐνης. Με εξαίρεση τα στελέχη εποχικής γρίπης Α(Η1Ν1) που απομονώθηκαν μέχρι το 2007 και 28 στελέχη Α(Η3Ν2) που κυκλοφόρησαν έως τις αρχές του 2006, από το 2008 και μετά επιβεβαιώθηκε σε όλα τα στελέχη γρίπης τύπου Α, συμπεριλαμβανομένων των Α(Η1Ν1)pdm09, η παρουσία της αα S31N στο γονίδιο της μητρικής Μ2 πρωτεΐνης, η οποία συνδέεται με αντοχή στις αμανταδάνες. Μόνο 5 Α(Η1Ν1)pdm09 στελέχη απομονωθέντα αποκλειστικά σε ανοσοκατεσταλμένους ασθενείς βρέθηκαν ανθεκτικά στην οσελταμιβίρη με την ενζυμική μέθοδο. Eπιβεβαιώθηκε γενετικά η παρουσία της αμινοξικής αντικατάστασης ιστιδίνης σε τυροσίνη στη θέση 275. Δε βρέθηκαν ανθεκτικά στελέχη ιού γρίπης A(H3N2) και Β στην οσελταμιβίρη. Όλα τα στελέχη γρίπης τύπου A και Β που εξετάστηκαν ήταν ευαίσθητα στη ζαναμιβίρη. Τα ευρήματα της μελέτης καταδεικνύουν την απουσία φυσικής αντοχής στα πανδημικά στελέχη γρίπης. Το εύρημα αυτό είναι σε αντίθεση με την ταυτοποίηση Α(Η1Ν1) στελεχών γρίπης ανθεκτικά στην οσελταμιβίρη (18.5%) κατά τη χειμερινή περίοδο 2007-08, χωρίς να μεσολαβήσει χρήση του παραπάνω αναστολέα. Η ταυτοποίηση ανθεκτικών ιών γρίπης στην οσελταμιβίρη σε ανοσοκατεσταλμένους ασθενείς και το μοτίβο εμφανίσεως αμινοξικών αντικαταστάσεων στα γονίδια της νευραμινιδάσης (αντιρροπιστικές) και αιμοσυγκολλητίνης τόσο στα ευαίσθητα όσο και στα ανθεκτικά στελέχη, επισημαίνουν την ανάγκη για τον αποτελεσματικό έλεγχο της μόλυνσης και την εξελικτική ανάλυση του ιού, αντιστοίχως.