Φασματοσκοπική μελέτη της επίδρασης των ακτινοβολιών στον ανθρώπινο αρθρικό χόνδρο

Abstract

In the present study, we used Fourier transform infrared spectroscopy in combination with high resolution optical microscope and Scanning Electron Microscopy (SEM) for the in vitro evaluation of the effects of ionizing radiation on articular cartilage, the interface with the bone as well as the bone tissue itself, in order to understand the chemical mechanism of the radiation therapy induced damage.From the intensity changes of the characteristic absorption bands and the appearance of new bands in the region between 4000-2800 cm-1, it was suggested that the damage caused to small doses of radiation up to 6 Gy are the cleavages of hydrogen bonds of glycosaminoglycans (hyaluronic acid) and collagenous proteins.The fragments of collagen and hyaluronic acid reacted together by co-polymerization to form products leading to decrease the viscosity of cartilage and thus increasing friction and finally damage of the cartilage. These results were confirmed by comparison of the spectra from arthritic or cancerous cartilage from respective patients.Changes in the spectral region between 1800-1400 cm-1, where the characteristic bending vibration bands of collagen and non-cola gene proteins absorb, showed the destruction of their secondary structure from a helix, which is prevalent in the normal configuration, in a random coil after the influence of ionizing radiation. Increasing the radiation dose, amyloid-like proteins are produced from the interactions between the protein fragments, due to hydroxyl free radicals and protein interactions.The appearance of the band at 1742 cm-1 suggests the peroxidation of cell membranes and is caused by the presence of oxygen, which, as the free biradical contributes to further destruction due to ionizing radiation. The band is attributed to malondialdehyde formation, a compound that is used as marker for the disease progression.In the spectral region 1400-900 cm-1, the characteristic vibration of -C-O-C- sugar groups are found. The increasing of the intensities of these bands is related with D-sugar molecules, as a result of polysaccharide chain brakes. The intensities of these bands depend on the radiation dose and increase proportionally to doses of about 9 Gy. In higher doses it was observed that the produced mediated-organic free radicals of the biological molecules react further with essential biomolecules alterating the toxic effect of radiation. In the region between 1300-900 cm-1, the carbohydrate spectral bands coexist with the stretching vibrations of phosphate groups of hydroxyapatite bone. From the shape of bands and the positions of the absorption maxima showing the amorphous calcium phosphate formation [Ca3(PO4)2] as a result of free calcium ions (Ca2+) of the cartilage with the phosphate groups of membrane phospholipids fragments.The FT-IR spectra of irradiated cartilage were also compared with those resulting from osteoarthritic and cancerous cartilage, and was found that the spectra showed similarities indicating that the reactive species of hydroxyl radicals, electrons and oxygen are involved during irradiation as well as in osteoarthritis and cancer development.The study of cartilage surface by optical microscopy and scanning electron microscopy (SEM) showed that the architecture after irradiation is similar to that caused to osteoarthritis.Data of the present study show that ionizing radiation during radiation therapy cause cleavage of glycozamikoglycan and collagenous protein chains, leading to a non reversible damage. These observations suggest that we should develop new therapeutic schemes to protect the healthy cells from radiation therapy induced damage.

Στην προύσα εργασία χρησιμοποιήθηκε η υπέρυθρη φασματοσκοπία με μετασχηματισμό Fourier σε συνδυασμό με οπτικό μικροσκόπιο υψηλή ανάλυσης και μικροσκόπιο διασποράς SEM (scanning electron microscopy) για την in vitro μελέτη της επίδρασης των ιοντιζουσών ακτινοβολιών στον αρθρικό χόνδρο, τη διεπιφάνεια με το οστούν, και για την προσέγγιση του χημικού μηχανισμού που προκαλείται κατά την ακτινοθεραπεία.Από τις μεταβολές των εντάσεων και τις νέες ταινίες στην περιοχή μεταξύ 4000-2800 cm-1, διαπιστώθηκε ότι οι βλάβες οι οποίες προκαλούνται σε μικρές δόσεις ακτινοβολίας μέχρι 6 Gy είναι οι σχάσεις των δεσμών υδρογόνου των γλυκοζαμινογλυκανών (πολυγλυκάνες, υαλουρονικό οξύ) και των κολλαγονούχων πρωτεϊνών.Τα θραύσματα του κολλαγόνου και υαλουρονικού οξέος αντιδρούν μεταξύ τους με διασταυρούμενο πολυμερισμό σχηματίζοντας προϊόντα στα οποία αποδίδεται η μείωση του ιξώδους των χόνδρων και επομένως η αύξηση της τριβής και τέλος η φθορά των χόνδρων. Τα αποτελέσματα αυτά επιβεβαιώθηκαν με σύγκριση ανάλογων χόνδρων οι οποίοι αφαιρέθηκαν από ασθενείς λόγω οστεοαρθρίτιδας ή άλλης αιτίας βλάβης του αρθρικού χόνδρου και καρκίνου.Οι μεταβολές στην περιοχή του φάσματος μεταξύ 1800-1400 cm-1, όπου εμφανίζονται οι χαρακτηριστικές δονήσεις των κολλαγονούχων πρωτεϊνών έδειξαν την καταστροφή της έλικας από α-έλικα, η οποία επικρατεί στην φυσιολογική κατάσταση, σε τυχαία περιέλιξη μετά την επίδραση των ιοντιζουσών ακτινοβολιών. Με αύξηση της δόσης ακτινοβολίας παράγονται αμυλοειδούς τύπου πρωτεΐνες από τα θραύσματα των πρωτεϊνών που παράγονται, λόγω της επίδρασης των ελευθέρων ριζών υδροξυλίου.Η εμφάνιση της ταινίας στα 1742 cm-1 αποδίδεται στην υπεροξείδωση των μεμβρανών των κυττάρων η οποία προκαλείται από την παρουσία του οξυγόνου, το οποίο, ως ελεύθερη δίριζα συμβάλλει στην περαιτέρω καταστροφή των ιοντιζουσών ακτινοβολιών. Η ταινία χαρακτηρίζει τον σχηματισμό μαλονδιαλδεΰδης, μία ένωση που αποτελεί δείκτη για την εξέλιξη της ασθένειας.Από τις ταινίες στην περιοχή του φάσματος μεταξύ 1400-900 cm-1 όπου εμφανίζονται οι χαρακτηριστικές δονήσεις των ομάδων –C-O-C- των σακχάρων διαπιστώνεται η αύξηση των D-σακχάρων, τα οποία προκύπτουν από την αύξηση των μονομερών. Οι εντάσεις των ταινιών αυτών εξαρτώνται από τη δόση ακτινοβολίας και αυξάνει αναλογικά μέχρι δόσεις περίπου 9 Gy. Πέραν αυτής της δόσης, οι παραγόμενες ελεύθερες ρίζες αντιδρούν περαιτέρω με βασικά βιομόρια και μεταβάλλουν την τοξική επίδραση της ακτινοβολίας.Στην περιοχή μεταξύ 1300-900 cm-1, οι ταινίες του φάσματος των σακχάρων συνυπάρχουν με τις ταινίες των φωσφορικών αλάτων του υδροξυαπατίτη των οστών. Από την μορφή των ταινιών και τις θέσεις των μεγίστων απορρόφησης φαίνεται ο σχηματισμός άμορφου φωσφορικού ασβεστίου [Ca3(ΡΟ4)2] ο οποίος προέρχεται από την αντίδραση των ιόντων ασβεστίου (Ca2+) του υγρού των χόνδρων με τις φωσφορικές ομάδες των φωσφολιπιδίων των κυτταρικών μεμβρανών.Τα FT-IR φάσματα συγκρίθηκαν με φάσματα ασθενών με οστεοαρθρίτιδα και διαπιστώθηκε ότι τα φάσματα παρουσιάζουν ομοιότητες, οι οποίες ερμηνεύονται με μηχανισμούς ελευθέρων ριζών.Η μελέτη της αρχιτεκτονικής των χόνδρων με οπτικό μικροσκόπιο και ηλεκτρονικό μικροσκόπιο σάρωσης (SEM) έδειξαν ότι η φθορά την οποία προκαλούν οι ιοντίζουσες ακτινοβολίες είναι ίδια με αυτή που προκαλεί η φυσιολογική γήρανση του ατόμου και εκδήλωση οστεοαρθρίτιδας.Τα δεδομένα της μελέτης δείχνουν ότι οι ιοντίζουσες ακτινοβολίες κατά την ακτινοθεραπεία προκαλούν σχάση των αλυσίδων των γλυκοζαμικογλυκανών και κολλαγονούχων πρωτεϊνών, οι οποίες οδηγούν σε μη αντιστρεπτές βλάβες. Οι παρατηρήσεις αυτές δείχνουν ότι θα πρέπει να αναπτυχθεί νέα σειρά θεραπευτικού σχήματος για την αντιμετώπιση των βλαβών, οι οποίες προκαλούνται στα υγιή κύτταρα τα οποία ακτινοβολούνται παράλληλα με τα παθολογικά.