Διερεύνηση του μηχανισμού της λεμφοπενίας σε πάσχοντες από χρόνια ιδιοπαθή ουδετεροπενία

Abstract

Objectives: Chronic idiopathic neutropenia (CIN) is a disorder of granulopoiesis characterised by presence of activated T-lymhocytes that induce/sustain apoptosis of bone marrow (BM) granulocytic progenitors. T-cell lymphopenia is commonly found in CIN. The aim of the study is to probe the mechanisms underlying T-cell lymphopenia in CIN.Methods: We investigated parameters of T-cell homeostasis namely the proliferation/apoptotic rate of naive and memory T-cells, the T-cell senescence by telomere measurement, the recent thymic T-cell production through quantification of T-cell receptor rearrangement excision circles (TRECs), and the production of interleukin (IL-7).Results: CIN patients (n=44) displayed lower proportion of naïve CD45RA+ cells within the CD4+ and CD8+ cells compared to controls (n=15). The proportion of apoptotic cells within the CD8+ fraction was higher in patients compared to controls and was correlated with the percentage of Ki-67+ cells indicating an activation-induced accelerated CD8+ cell death. The TREC content of CD4+ and CD8+ cells was lower in patients compared to controls and was correlated with the proportion of CD45RA+ CD4+ and CD8+ cells and with the levels of serum and BM IL-7 which were significantly decreased in the patients. The mean relative telomere length of CD4+ and CD8+ cells was significantly lower in CIN patients compared to age-matched controls. Conclusions: The aberrant T-cell expansions associated with the pathogenesis of CIN result in increased proliferation/apoptosis and possibly exhaustion of PB T-cells which, in association with the inadequate compensatory thymic export of new TREC expressing T-cells partially due to IL-7 deficiency, may contribute to lymphopenia in CIN.

Η Χρόνια ιδιοπαθής Ουδετεροπενία (Chronic Idiopathic Neutropenia; CIN) είναι μια επίκτητη διαταραχή της κοκκιοποίησης και χαρακτηρίζεται από παρατεταμένη και ανεξήγητη μείωση των ουδετεροφίλων [Dale DC, Medicine, 1979]. H παθοφυσιολογία της νόσου έγκειται στη διαταραχή της κοκκιοποίησης λόγω του αυξημένου ποσοστού ενεργοποιημένων Τ-κυττάρων στο μυελό των οστών και την ακόλουθη παραγωγή ανασταλτικών κυτταροκινών και προαποπτωτικών μορίων [Papadaki HA, Blood, 2003] [Papadaki HA, Br J Haematol, 2005]. Ωστόσο, το αυξημένο ποσοστό των διεγερμένων Τ λεμφοκυττάρων μπορεί να σημαίνει ότι υπάρχει πιθανότητα αυξημένης απόπτωσης των κυττάρων αυτών, το οποίο θα μπορούσε να οδηγήσει σε αντιρροπιστική αύξηση του πολλαπλασιασμού των περιφερικών Τ-λεμφοκυττάρων και αυξημένη, κατά το δυνατό, παραγωγή Τ-λεμφοκυττάρων από τον θύμο αδένα προκειμένου να διατηρηθεί η ομοιόσταση του Τ-κυτταρικού διαμερίσματος . Kατά τη φάση παραγωγής των Τ-λεμφοκυττάρων στον θύμο, τα προερχόμενα από τον μυελό των οστών προγονικά Τ-κύτταρα μεταναστεύουν στον θύμο όπου εκπτύσσονται και ωριμάζουν. Μία εναλλακτική οδός, και με δεδομένο ότι η παραγωγή στον θύμο μειώνεται λόγω ηλικίας, είναι η ταχεία κυτταρική διαίρεση των ώριμων Τ-κυτταρικών κλώνων διαδικασία που ονομάζεται «ομοιοστατική περιφερική έκπτυξη» (homeostatic peripheral expansion, HPE) και η οποία χρησιμεύει όχι μόνο για την αύξηση του αριθμού των Τ- κυττάρων αλλά και για τη διατήρηση του ρεπερτορίου των Τ-λεμφοκυττάρων στον μεγαλύτερο δυνατό βαθμό [Guimond M , J.of Immunotherapy,2005] [Williams KM,Best Pract res Clin.Haematol.2008].Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι η κύρια κυτταροκίνη που επάγει την παραγωγή των Τ-λεμφοκυττάρων στον θύμο, αλλά και τον πολλαπλασιασμό τους και την επιβίωση τους στην περιφέρεια, συμβάλλοντας ουσιαστικά στη ρύθμιση της ομοιόστασης του διαμερίσματος των Τ-κυττάρων, είναι η IL-7 (interleukin-7) [Poncel F,J.Leukoc. Biol.2005][Fry Tj,. ,Trends Immunol 2001] [Fry Tj.,Blood, 2002][Ponchel. ,Clin. Chim. Acta 2011]. Η κυτταροκίνη αυτή παράγεται κυρίως από τά στρωματικά κύτταρα του μυελού των οστών και από τα επιθηλιακά κύτταρα του θύμου αδένα και η παραγωγή της καταστέλλεται από τον TGF-β1 (Transforming Growth Factor –β1) [Fry Tj, Blood, 2001]. Ας σημειωθεί ότι ο TGF-β1 βρίσκεται σε αυξημένα επίπεδα στο μικροπεριβάλλον του μυελού των οστών ασθενών με χρόνια ιδιοπαθή ουδετεροπενία (chronic idiopathic neutropenia, CIN) [Papadaki HA ,Eur J Haematol.1999]Το 37% των ασθενών με CIN έχουν μικρότερο αριθμό κυκλοφορούντων λεμφοκυττάρων στο αίμα συγκριτικά με υγιή άτομα ίδιου φύλου και αναλόγου ηλικίας. Η παρατηρούμενη λεμφοπενία αφορά κυρίως τη μείωση του αριθμού των Τ-λεμφοκυττάρων και σε μικρότερο βαθμό των ΝΚ-κυττάρων αλλά όχι και των Β-κυττάρων. Επιπλέον, υπάρχει θετική συσχέτιση μεταξύ του αριθμού των κυκλοφορούντων λεμφοκυττάρων και του αριθμού των κυκλοφορούντων ουδετερόφιλων στο αίμα των ασθενών. [Kyriakou D, Ann Hematol,1997] [Papadaki ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΜΕΛΕΤΗΣΟ σκοπός της μελέτης αυτής ήταν η διερεύνηση των μηχανισμών της παρατηρούμενης λεμφοπενίας σε ασθενείς με CIN και συγκεκριμένα, ο έλεγχος της παραγωγής ανοσολογικά παρθένων Τ-κυττάρων στο θύμο και η απόπτωση αυτών στην περιφέρεια, καθώς και τα χαρακτηριστικά γήρανσης των περιφερικών Τ-κυττάρων σε συνδυασμό με την Τ-κυτταρική παραγωγή στο θύμο αδένα σε ασθενείς με αυστηρά καθορισμένα διαγνωστικά κριτήρια της νόσου. ΑΣΘΕΝΕΙΣ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Μελετήθηκαν 44 ασθενείς με CIN, 8 άνδρες και 36 γυναίκες ηλικίας 34-73 ετών (διάμεση ηλικία 43 έτη), που πληρούσαν τα διαγνωστικά κριτήρια της νόσου [Papadaki HA, Blood, 2003].Συγκεκριμένα οι ασθενείς είχαν αριθμό κυκλοφορούντων ουδετερόφιλων μικρότερο των 1800 x 106/L (μέση τιμή 1325 ± 321 x 106/L, εύρος 600-1700 x 106/L) για χρονικό διάστημα 37-208 μηνών (διάμεσο διάστημα 60 μηνών). Επίσης, οι ασθενείς δεν είχαν ιστορικό υποκείμενης νόσου που θα μπορούσε να σχετίζεται με ουδετεροπενία όπως αποδείχτηκε με ενδελεχή κλινικοεργαστηριακό έλεγχο, δεν είχαν ιστορικό πρόσφατης λήψης φαρμάκων που προκαλούν ουδετεροπενία, δεν είχαν λάβει κατά το παρελθόν χημειοθεραπεία και δεν είχαν εκτεθεί σε ακτινοβολία, είχαν δε αρνητικές δοκιμασίες για αντιπολυμορφοπυρηνικά αντισώματα για αποκλεισμό αυτοάνοσης ουδετεροπενίας.Αρχικά μελετήθηκε με κυτταρομετρία ροής ο βαθμός διέγερσης αλλά και απόπτωσης των Τ-λεμφοκυτταρικών υποπληθυσμών του αίματος των ασθενών σε σύγκριση με υγιείς μάρτυρες. Επιπλέον ο ρυθμός πολλαπλασιασμού των Τ-λεμφοκυττάρων διερευνήθηκε με τον προσδιορισμό του μεγέθους των τελομερών με την τεχνική της Real Time PCR [Koetz K ,Proc Natl Acad Sci 2000] αλλά και με προσδιορισμό του πυρηνικού δείκτη Ki67 με κυτταρομετρία ροής, που αντιστοιχεί στον αριθμό των κυττάρων που βρίσκονται σε φάση πολλαπλασιασμού σε δεδομένη στιγμή [Gerdes J, J Immunol1984]. Μελετήθηκε, επίσης, η παραγωγή νέων Τ-λεμφοκυττάρων από τον θύμο αδένα με τον προσδιορισμό στα περιφερικά Τ-λεμφοκύτταρα των κυκλικών τμημάτων εξω- χρωμοσωμικού DNA (T-cell rearrangement excision circles, TRECs) που προκύπτουν κατά την διαδικασία του γονιδιακού ανασυνδιασμού της α–αλυσίδας του υποδοχέα του Τ-λεμφοκυττάρου (T-cell receptor TCR) με την τεχνική της Q Real Time PCR [Hazenberg MD Nat.Med ,2000,] [Ping YE,Critical Rev. Immunol.2002][Hazenberg MD, J Mol.Med,2001]. Τέλος, προσδιορίστηκαν τα επίπεδα της IL-7 στον ορό των ασθενών με CIN αλλά και σε υπερκείμενα μακρόχρονων μυελικών καλλιεργειών με ανοσοενζυμική μέθοδο (ELISA).ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑΣτην παρούσα μελέτη δείχθηκε ότι η λεμφοπενία στους ασθενείς με CIN σχετίζεται με το μειωμένο αριθμό των CD4+ και CD8+ λεμφοκυττάρων στο περιφερικό αίμα και το χαμηλό ποσοστό των παρθένων (naive) T κυττάρων (CD45RA+) καθώς και των μνημονικών (CD45RO+) κυττάρων.Επίσης δείχθηκε από κυτταρομετρική ανάλυση του δείκτη πολλαπλασιασμού Ki67 ότι τα CD4+ και CD8+ λεμφοκύτταρα έχουν αυξημένη πολλαπλασιαστική ικανότητα όπως επιβεβαιώνεται και από το μειωμένο μήκος των τελομερών των κυττάρων αυτών.Την παραγωγή νέων λεμφοκυττάρων από τον θύμο αδένα την προσδιορίσαμε με την μέτρηση των TRECs στα περιφερικά Τ-λεμφοκύτταρα, τα οποία βρέθηκαν σημαντικά χαμηλότερα και στα CD4+ και στα CD8+ των ασθενών σε σύγκριση με τους υγιείς μάρτυρες.Υπήρξε θετική συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων των TREC και των ποσοστών των CD45RA+ παρθένων CD4+ και CD8+ κυττάρων που υποδεικνύει μια ελαττωμένη παραγωγή από το θύμο στους ασθενείς με CIN. Επιπλέον βρέθηκε μια αρνητική συσχέτιση μεταξύ του αριθμού των TREC και του ποσοστού των πολλαπλασιαζόμενων Ki67 κυττάρων μέσα στο κλάσμα των CD4+ και CD8+ κυττάρων. Ο αποπτωτικός ρυθμός των ανωτέρων κυτταρικών πληθυσμών ήταν σημαντικά αυξημένος στους ασθενείς με CIN.Τέλος οι ασθενείς με CIN έχουν σημαντικά χαμηλότερα επίπεδα IL-7 συγκριτικά με τους μάρτυρες στον ορό και σε υπερκείμενα μακρόχρονων καλλιεργειών και υπάρχει σημαντική συσχέτιση στα επίπεδα κυτταροκίνης στον ορό και στο περιεχόμενο σε TREC στα CD4+ καιCD8+ κύτταρα.ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΗ Τ-λεμφοπενία στη CIN είναι πολυπαραγοντική. Συγκεκριμένα, υπάρχει πρόωρη μείωση του μήκους των τελομερών των Τ-λεμφοκυττάρων του περιφερικού αίματος που θα μπορούσε να αποδοθεί στην εξάντληση των Τ κυττάρων πιθανότατα λόγω του αυξημένου πολλαπλασιασμού ως απάντηση σε αντιγονική διέγερση. Φλεγμονώδες κυτταροκίνες πού σχετίζονται με την παθοφυσιολογία της CIN επηρεάζουν πιθανώς την παραγωγή της IL-7 με αποτέλεσμα την ανεπαρκή αντισταθμιστική θυμική παραγωγή νέων Τ-κυττάρων που εκφράζουν TREC. Ο αυξημένος αποπτωτικός θάνατος των διεγερμένων Τ-λεμφοκυττάρων είναι επιπρόσθετος παράγοντας μείωσης τού διαμερίσματος των κυκλοφορούντων Τ-λεμφοκυττάρων αφού η ελαττωμένη παραγωγή IL-7 ενδέχεται να μην επιτρέπει την αντιρροπιστική αύξηση της παραγωγής τους στον θύμο, τουλάχιστο σε βαθμό ανάλογο της περιφερικής καταστροφής.