Μελέτη της ελάχιστης υπολειπόμενης νόσου στην οξεία λεμφοβλαστική λευχαιμία της παιδικής ηλικίας

Abstract

In Β and Τ cell lineage acute lymphoblastic leukemias (B and T-ALL), the clonal rearrangements of the immunoglobulin heavy chain (IgH) and T-cell receptor (TcR) gene loci, can be used as molecular markers for the detection of minimal residual disease (MRJD). Patients in complete remission may still harbor leukemic cells undetectable by conventional methods such as light-microscopic examination, immunophenotyping and cytogenetics. Treatment of patients with ALL with identical protocols leads to relapse or reemergence of MRD in a proportion of patients indicating that each case may have to be treated according to its MRD status. Different levels of MRD among several patients with ALL may impose modification of therapy. 96 children were screened at diagnosis by polymerase chain reaction (PCR) for their IgH and/or TcR gene repertoire. 49/96 patients (250 samples) were studied for the detection of MRD in various periods after diagnosis. 7/49 patients were extensively studied using patient-specific oligonucleotide probes derived from the sequence analysis of bone marrow (BM) samples at diagnosis. 96 PCR products from follow-up BM samples corresponding to these 7 patients were hybridized with the appropriate clone-specific probe in order to detect MRD with high sensitivity and specificity. All the patients were in morphological remission during and after therapy. 84/96 patients were PCR positive at diagnosis. 20/49 patients had detectable MRD with the single use of PCR and 6/7 patients who were examined for MRD with the use of clone-specific probes had detectable disease in various periods after diagnosis with improved sensitivity leading to the detection of a single leukemic cell among 10⁵ normal cells, offering accurate and significant diagnostic and prognostic information. Molecular signs of residual cells can persist for a long time during and after therapy. Long term follow-up of MRD could determine the period of therapy and predict relapse indicating therapeutic interventions.

Ο σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν η ανάπτυξη και εφαρμογή μοριακών μεθόδων ταυτοποίησης του λευχαιμικού πληθυσμού κατά τη διάγνωση της νόσου, ανίχνευσης της ελάχιστης υπολειπόμενης νόσου (ΕΥΝ) με μεγάλη ευαισθησία και ειδικότητα. Οι μοριακοί δείκτες που χρησιμοποιήθηκαν για τη διάγνωση και παρακολούθηση των ΟΛΛ ήταν η βαριά αλυσίδα της ανοσοσφαιρίνης και ο υποδοχέας των Τ-λεμφοκυττάρων. Η πειραματική λογική βασίσθηκε στην προσπάθεια κατασκευής ειδικών ανιχνευτών του αρχικού λευχαιμικού κλώνου κατά τη διάγνωση της ΟΛΛ, που θα προσδιόριζαν το μοριακό του πρότυπο και που θα παρακολουθούσαν τη νόσο κατά τη διάρκεια της θεραπείας αλλά και μετά το τέλος της. Από τους 96 ασθενείς η συστηματική μελέτη που αφορά αποκλειστικά την ΕΥΝ επικεντρώθηκε σε 49, στους οποίους αναλύθηκαν 250 δείγματα παρακολούθησης. Σε 20/49 (40,81%) ασθενείς, ανιχνεύθηκε ΕΥΝ σε διάφορα χρονικά διαστήματα. 18/49 ασθενείς εξετάσθηκαν με PCR στο τέλος της θεραπείας συντήρησης και σε 5 από αυτούς (27,77%) ανιχνεύθηκε ΕΥΝ. Η χρήση των ανιχνευτών προσδιορίζει συγκεκριμένα επίπεδα ΕΥΝ με ευαισθησία που προσεγγίζει το 10-5. Η αδυναμία των μεθόδων που βασίζονται στη μορφολογική παρακολούθηση των κλωνικών πληθυσμών να προσδιορίσουν ΕΥΝ δίδει επιπλέον αξία στις μοριακές μεθόδους που αξιολογούνται πλέον ως ανεξάρτητοι δείκτες της πορείας της νόσου και συμπληρώνουν το κλινικό έργο. Η εφαρμογή των μοριακών μεθόδων κατά την παρακολούθηση της νόσου μπορεί να διαπιστώσει κάθε στιγμή την ύπαρξη ή μη μοριακής ύφεσης, αφού πλέον, η μορφολογική ύφεση της νόσου πρέπει επιβεβαιώνεται και με τη μοριακή ύφεση.