Ο ρόλος του αντιμεταφορέα νατρίου/υδρογόνου NHE-1 στη διαφοροποίηση των μονοκυττάρων

Abstract

Monocytes can differentiate into macrophages and several other phagocyte cell types, like osteoclasts. Sodium/Hydrogen exchanger (NHE-1) signaling has been related with macrophage differentiation and activation. On the other hand, it has been reported that monocytes may also dedifferentiate into an ancestor form and re-differentiate practically into any other cell line. NHE-1 is a central signaling molecule since it is related not only to internal pH housekeeping, but also it represents a focal adhesion site related with the cytoskeleton and Rho signaling. In the present study we examined monocyte to functional macrophage and monocyte to osteoclast differentiation as well as monocytes’ ability to dedifferentiate into an ancestor form and redifferentiate to osteoblasts, adipose tissue cells, neural and pancreatic-like cells. We also checked the possibility of dedifferentiated cells’ culture and proliferation as well as the expression of specific markers, that characterize the very small cells that resemble embryonic cells (VSEL), by them. The role of sodium/hydrogen exchanger, NHE-1, in these mechanisms and the involvement of PI3K and PKC kinases in the monocytes to functional macrophages differentiation were also examined. According to our results it is concluded that monocytes can be easily isolated from adult peripheral blood and can be cryopreserved. Human peripheral blood monocytes can easily differentiate in vitro to osteoclasts and functional macrophages and the inhibition of NHE-1 prevents these mechanisms. All the isoforms of PKC kinases except α, β1 and β2, seem to be involved in the monocytes to macrophage differentiation. PI3K kinases do not affect the role of NHE-1 in this mechanism. PKC kinases do not seem to be involved in the mechanism of phagocytosis of monocyte-derived macrophages. On the other hand, NHE-1 participates and influences this mechanism. Furthermore, human peripheral blood monocytes, under the influence of growth factors, cytokines and reducing agents, can easily dedifferentiate in vitro to precursor cells of monocytic type, whereas the NHE-1 does not seem to be involved in this mechanism. Dedifferentiated monocytes are unable to proliferate in vitro after their dedifferentiation, based on the experimental protocol followed in this study, and despite their small size, they do not express specific markers that characterize the very small cells that resemble embryonic cells (VSEL). However, under appropriate culture conditions in vitro, they redifferentiate to osteoblasts and adipose cells, whereas NHE-1 does not seem to be involved in these mechanisms. Based on the experimental protocol followed in the present study, it was not feasible to redifferentiate dedifferentiated monocytes to neural and / or pancreatic-like cells in vitro. In summary, NHE-1 seems to participate only in the mechanisms of monocyte differentiation in phagocytes and not in the mechanisms of dedifferentiation/redifferentiation. Inhibition of NHE-1 limits the differentiation of monocytes to mature osteoclasts and to functional macrophages, suggesting the possible role of NHE-1 inhibitors in the treatment and / or prevention of atherosclerosis and osteoporosis.

Τα μονοκύτταρα του περιφερικού αίματος ενηλίκων διαφοροποιούνται σε μακροφάγα και άλλα φαγοκυτταρικού τύπου κύτταρα, όπως είναι οι οστεοκλάστες. Η σχετιζόμενη με τον αντιμεταφορέα νατρίου/υδρογόνου, NHE-1, μεταβίβαση σήματος έχει συσχετισθεί με τη διαφοροποίηση και την ενεργοποίηση των μακροφάγων. Επιπλέον, είναι γνωστό ότι τα μονοκύτταρα αποδιαφοροποιούνται σε πρόδρομες μορφές τους και επαναδιαφοροποιούνται πρακτικά σε οποιαδήποτε κυτταρική σειρά. Ο NHE-1 αποτελεί κεντρικό μόριο στη μεταβίβαση του σήματος στα κύτταρα και εμπλέκεται όχι μόνο στη διατήρηση του ενδοκυτταρικού pH, αλλά και στη σύνδεση με τον κυτταροσκελετό και τη σχετική με τις Rho κινάσες σηματοδότηση. Στην παρούσα εργασία εξετάστηκε η ικανότητα διαφοροποίησης των μονοκυττάρων προς οστεοκλάστες και προς λειτουργικά μακροφάγα καθώς και η ικανότητα αποδιαφοροποίησης και επαναδιαφοροποίησής τους σε οστεοβλάστες, λιπώδη, νευρικά και παγκρεατικά κύτταρα. Ελέγχθηκε επίσης η ικανότητα πολλαπλασιασμού των αποδιαφοροποιημένων μονοκυττάρων μετά τη διαφοροποίησή τους καθώς η έκφραση δεικτών οι οποίοι χαρακτηρίζουν τα πολύ μικρά κύτταρα που μοιάζουν με τα εμβρυικά κύτταρα (VSEL). Τέλος, διερευνήθηκε ο ρόλος του ΝΗΕ-1 στους εν λόγω μηχανισμούς καθώς και η συμμετοχή των κινασών PKC και PI3K στη διαφοροποίηση των μονοκυττάρων προς μακροφάγα. Με βάση τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης συμπεραίνεται ότι τα μονοκύτταρα μπορούν εύκολα να απομονωθούν από το περιφερικό αίμα ενηλίκων και να κρυοσυντηρηθούν. Τα μονοκύτταρα ανθρώπινου περιφερικού αίματος ενηλίκων μπορούν εύκολα να διαφοροποιηθούν in vitro προς οστεοκλάστες και λειτουργικά μακροφάγα και η αναστολή του ΝΗΕ-1 παρεμποδίζει τους εν λόγω μηχανισμούς. Στη διαφοροποίηση των μονοκυττάρων προς μακροφάγα φαίνεται να εμπλέκονται όλες οι ισομορφές των PKC κινασών, εκτός των κλασικών α, β1 και β2. Οι κινάσες PI3K δεν επηρεάζουν το ρόλο του ΝΗΕ-1 στον εν λόγω μηχανισμό. Στο μηχανισμό φαγοκυττάρωσης των προερχόμενων από τα μονοκύτταρα μακροφάγων δε φαίνεται να εμπλέκονται οι κινάσες PKC. Αντίθετα, ο ΝΗΕ-1 συμμετέχει και επηρεάζει τον εν λόγω μηχανισμό. Επιπρόσθετα, τα μονοκύτταρα ανθρώπινου περιφερικού αίματος ενηλίκων, υπό την επίδραση αυξητικών παραγόντων, κυτοκινών και αναγωγικών παραγόντων, μπορούν εύκολα να αποδιαφοροποιηθούν in vitro προς πρόδρομα μονοκυτταρικού τύπου κύτταρα, ενώ ο ΝΗΕ-1 δε φαίνεται να εμπλέκεται στον εν λόγω μηχανισμό. Τα αποδιαφοροποιημένα μονοκύτταρα δεν είναι ικανά να πολλαπλασιαστούν in vitro μετά την αποδιαφοροποίησή τους, με βάση το πειραματικό πρωτόκολλο που ακολουθήθηκε στα πλαίσια της παρούσας εργασίας, και παρά το μικρό τους μέγεθος, δεν εκφράζουν δείκτες οι οποίοι χαρακτηρίζουν τα πολύ μικρά κύτταρα που μοιάζουν με τα εμβρυικά κύτταρα (VSEL). Υπό κατάλληλες όμως συνθήκες καλλιέργειας επαναδιαφοροποιούνται in vitro προς οστεοβλάστες και λιπώδη κύτταρα, ενώ ο ΝΗΕ-1 δε φαίνεται να εμπλέκεται στους εν λόγω μηχανισμούς. Με βάση το πειραματικό πρωτόκολλο που ακολουθήθηκε στα πλαίσια της παρούσας εργασίας, δεν ήταν εφικτή η επαναδιαφοροποίηση των αποδιαφοροποιημένων μονοκυττάρων προς νευρικά ή/και παγκρεατικά κύτταρα in vitro. Συνοψίζοντας, ο ΝΗΕ-1 φαίνεται να συμμετέχει μόνο στους μηχανισμούς διαφοροποίησης των μονοκυττάρων προς φαγοκύτταρα και όχι στους μηχανισμούς αποδιαφοροποίησης/επαναδιαφοροποίησης. Η αναστολή του ΝΗΕ-1 περιορίζει τη διαφοροποίηση των μονοκυττάρων προς λειτουργικά μακροφάγα και προς ώριμους οστεοκλάστες, γεγονός που υποδεικνύει τον πιθανό ρόλο των αναστολέων του ΝΗΕ-1 στη θεραπεία ή/και στην πρόληψη της αθηρωμάτωσης και της οστεοπόρωσης.