Βιοσύνθεση υδρολυτικών ενζύμων από θερμόφιλους μικροοργανισμούς

Abstract

The ability of microorganisms to grow or thrive in a large variety of environmental conditions reflects their unique structural and metabolic characteristics. The observation and subsequent exploitation of extraordinary microbial, genetic or functional diversity may be the solution to different environmental and industrial problems. Enzyme bioprospecting is a research activity devoted to the search of novel, versatile and efficient biocatalysts and has increased recently the market potential of enzymes. A general biotechnological perspective recognizes thermostabilitity as a desirable feature of the biocatalyst, in order to participate in remarkable and unusual bioprocesses. Consequently, thermophiles are microorganisms of interest for enzyme bioprospecting activities due to their habitat-related characteristics. In the present PhD Thesis, a collection of 101 thermophilic bacterial strains were used as biological source of hydrolytic enzymes. These strains have been isolated from different ecological niches around Santorini volcano during the study of the prokaryotic diversity of the volcanic island (Meintanis Christos, PhD Thesis, 2005). All the 101 bacterial strains were able to grow at high temperatures (60 ⁰C) and regarding their BOX PCR fingerprinting, they were discriminated into 3 large groups. Primarily, the cellulose and xylan potential of 101 thermophilic bacterial isolates was thoroughly evaluated. 80 % of the strains showed xylanolytic activity in plate assays and among these 8 % exhibited simultaneously activity towards cellulose hydrolysis (SP17, SP24, SP37, SP38, SP45, SP46, SP47, SP50). The latter strains, along with additional seven (SP8, SP11, SP59, SP68, SP69, SP74, SP87), that showed the highest xylanolytic levels, were selected for further studies. The phenotypic and genotypic characterization (16S rDNA) of the fifteen selected isolates revealed phylogenetic similarity with the genus Geobacillus and followed by the assessment of the enzymatic profile in liquid cultures using various carbon sources. Wheat bran proved to be an efficient inducer for both cellulase and xylanase production by the majority of the selected thermophilic bacilli. Strain SP24 was further selected for its ability to produce elevated levels of cellulase, xylanase, β-glucosidase and β-xylosidase and was chosen as a representative strain in order to study the physiology of expression of the biomass degrading enzymes. More precisely, the research included the examination of the effect of additional carbon/nitrogen sources as a supplement to wheat bran on enzyme biosynthesis in a series of shake flasks, followed by the study of the effect of aeration conditions in microorganism growth and enzyme production in a series of bioreactor experiments and also, the localization of all enzyme activities in all SP24 cultures. Maximum enzyme production by this strain was obtained using a combination of wheat bran (basic carbon source) and birchwood xylan (supplement) in the growth medium. Additional, aeration levels had a very profound positive effect on viable growth since it affected, both the maximum determined biomass concentration as well as the growth rate. The production of all biomass degrading enzymes was growth associated since it followed more or less the cells’ concentration. Cellulase, xylanase and β-xylosidase production was enhanced at high aeration levels while the biosynthesis of β-glucosidase was strongly inhibited. The cellulase and xylanase activity was localized extracellularly, in agreement with the inability of cellulose and xylan (natural substrates) to penetrate the cell wall and membrane. An interesting observation was the effect of aeration levels in secretion rate of both cellulase and xylanase. At the highest aeration level the corresponding activities were 100 % extracellularly detected, following the faster bacterial growth. On the contrary, β-glucosidase and xylosidase appeared as cell-bound enzymes with most of their activity being detected at the cytosolic cell-bound fraction during the early stages of growth. At the latter stages of growth, the activity of both glucosidases was localized at the culture supernatant, probably as a result of partial autolysis of the cells. All the above data yielded enzyme mixtures suitable for various biotechnological and research applications. Moreover, the amplification of cellulase and xylanase genes, using the genomic DNA of the selected strain as a template, allows the cloning and overexpression of the corresponding genes in mesophilic hosts in the future. The second part of the present PhD Thesis, included the evaluation of the lipolytic potential of the same collection of 101 thermophilic bacteria. The ability of isolated bacteria to produce lipase was determined on both solid and liquid cultures with olive oil as sole carbon source. This screening resulted in the selection of 9 strains (SP14, SP22, SP29, SP73, SP75, SP76, SP79, SP83 και SP93) capable to produce elevated levels of lipases. None of the above lipolytic bacteria was chosen for its xylanolytic or cellulolytic activity. The phenotypic and genotypic identification (16S rDNA) of the nine selected isolates classified them close to the genus Geobacillus. Subsequently, the lipolytic strains were cultured in liquid and solid media using different carbon sources. The assessment of the lipolytic profile showed that the enzyme production was not constant and the best inducers were tributyrin and Tween 20 in the majority of the selected strains. In order to determine the optimum pH and T as well as thermal stabilities of the lipolytic activities in their culture supernatants, the lipolytic strains were grown in liquid cultures. All the enzymes revealed optimal lipolytic activity at 80-100 oC, pH 8-9 and increased thermostability. Nevertheless, the low protein expression level did not allow the enzyme purification from the supernatant of the wild type bacterial cultures. The secreted lipase from strain SP22 had the most desirable biotechnological features and the genomic DNA of this strain was the template for gene amplification. The PCR primers for lipase gene amplification were designed based on conserved DNA sequences of reported lipases from the genus Geobacillus and the corresponding gene was amplified (1251 b.p) and fully sequenced (GenBank JN711121) after cloning in pBluescript SK(+) vector. The lipase gene codes for a mature lipase of 416 amino acid residues, corresponding to a molecular weight of 46 kDa. As in other Bacillus lipases, an Ala replaces the first Gly in the conserved pentapeptide Gly-X-Ser-X-Gly found in most lipases. Sub-cloning of the lipase orf into pET-15b vector and subsequent transformation into E. coli host cells (DH5a, BL21(DE3) and BL21(DE3)pLysS) resulted in low expression levels probably due to the formation of inclusion bodies resulting from the highly hydrophobic nature of the enzyme, the high isoelectric point of the protein or some required posttranslational modifications (improper folding). Following these results, we attempted for the first time in literature, the overexpression of a thermostable bacterial lipase in baculovirus-infected insect cells (flashBACTM expression system). The recombinant lipase was secreted as a highly active enzyme at yields, under optimized conditions (MOI, time course), 10000- and 5000-fold higher than the wild type strain and the heterologous bacterial system, respectively, while the corresponding specific activities were among the highest reported for a lipase gene. The next step was the purification of the overexpressed lipase from the insect cell culture supernatant in a single chromatographic step (Q-Sepharose Fast Flow) using buffers containing Triton X-100 and gum arabic (emulsion). The recombinant lipase had an optimum temperature and pH of 65 oC and pH 9, respectively and it was stable up to 65 oC at pH 7 and active over a wide pH range (pH 6-11). Moreover, the purified enzyme exhibited stability towards various organic solvents and detergents but it was completely inhibited in the presence of SDS. The lipase activity was promoted in the presence of Ca2+ and was strongly inhibited by EDTA. With respect to substrate specificity, the lipolytic enzyme showed high affinity towards pNPC (C8) but elevated reaction rate towards pNPP (C16) and was more efficient in the hydrolysis of pNPL (C12). Finally, the lipase activity was investigated in esterification reactions using the ionic liquids 1-butyl-3-methylimidazolium tetrafluoroborate or hexafluorophosphate as reaction media and tyrosol as substrate. The synthesis of tyrosyl lipophilic derivatives is rising lately as a response to the food, cosmetic and pharmaceutical industries' increasing demand for new lipophilic antioxidants. The thermostable recombinant lipase was able to catalyze the esterification of tyrosol with vinyl butyrate. The nature of the ionic liquid and the enzyme condition (lyophilized or immobilized) affected the yield of product. The immobilization of the lipase on Celite increased the reaction rate about 30 % probably due to the higher stability of the enzyme and these yields are comparable with different commercial formulations.

Η ικανότητα των μικροοργανισμών να επιβιώνουν σε μεγάλη ποικιλία αβιοτικών παραγόντων αντανακλά τα ιδιαίτερα δομικά και μεταβολικά χαρακτηριστικά τους. Η συστηματική καταγραφή και αξιοποίηση της μικροβιακής γενετικής και λειτουργικής ποικιλότητας ακραίων ενδιαιτημάτων ενδέχεται να δώσει λύσεις σε περιβαλλοντικά και βιομηχανικά προβλήματα. Αναφορικά με τις βιοτεχνολογικές εφαρμογές της ενζυμικής κατάλυσης, η ανάγκη εξεύρεσης ποικιλόμορφων, αποδοτικών και σταθερών βιοκαταλυτών για συμμετοχή σε μη συμβατικές συνθήκες διεργασιών, έστρεψε το ενδιαφέρον στη μελέτη του μεταβολικού δυναμικού των θερμόφιλων μικροοργανισμών. Στην παρούσα Διδακτορική Διατριβή χρησιμοποιήθηκε ως βιολογική πηγή υδρολυτικών ενζύμων ένα σύνολο 101 θερμόφιλων βακτηριακών στελεχών που είχαν απομονωθεί κατά τη Διδακτορική Διατριβή του Μεΐντάνη Χ. (2005) στο Εργαστήριο Μικροβιολογίας, του Τομέα Βοτανικής, του Τμήματος Βιολογίας Πανεπιστημίου Αθηνών κατά τη διάρκεια μελέτης της συστηματικής καταγραφής και ποικιλότητας επιλεγμένων οικοθέσεων του ηφαιστειακού συμπλέγματος της Σαντορίνης. Τα στελέχη αυτά, στην πλειοψηφία τους εμφάνισαν φυλογενετική συγγένεια με το γένος Geobacillus και ομαδοποιήθηκαν με βάση το αποτύπωμα BOX PCR τους σε 3 ομάδες. Αρχικά, εκτιμήθηκε ποιοτικά το κυτταρινολυτικό και ξυλανολυτικό δυναμικό του συνόλου των θερμόφιλων μικροοργανισμών από το οποίο προέκυψε ένα υψηλό ποσοστό βακτηρίων με ανιχνεύσιμη ενεργότητα ξυλανάσης (80 %) ενώ μόλις το 8 % παρουσίασε ικανότητα ταυτόχρονης υδρόλυσης κυτταρίνης και ξυλάνης. Για την περαιτέρω μελέτη, επιλέχθηκαν 8 στελέχη που εμφάνισαν ταυτόχρονη κυτταρινολυτική και ξυλανολυτική δράση (SP17, SP24, SP37, SP38, SP45, SP46, SP47, SP50) καθώς και επιπλέον 7 με τις υψηλότερες σχετικές ενεργότητες ξυλανάσης (SP8, SP11, SP59, SP68, SP69, SP74, SP87). Ακολούθησε ο φαινοτυπικός και γενετικός χαρακτηρισμός των επιλεγμένων στελεχών καθώς και ο ποσοτικός προσδιορισμός της υδρολυτικής τους ικανότητας σε καλλιέργειες διαφορετικών πηγών άνθρακα. Το στέλεχος SP24 (κωδικός NCBI-JN692241) εμφάνισε ταυτόχρονη έκκριση ένδο- ξυλανάσης και κυτταρινάσης καθώς και β-ξυλοζιδάσης και β-γλυκοζιδάσης σε ικανοποιητικά επίπεδα, παρουσία πιτύρου σίτου, και επιλέχθηκε για περαιτέρω μελέτη της βιοσύνθεσης των κυτταρινολυτικών και ξυλανολυτικών του ενζύμων. Αναλυτικότερα, μελετήθηκε η επίδραση μικρής ποσότητας συμπληρωματικών πηγών άνθρακα και αζώτου στην ενζυμική επαγωγή υγρών καλλιέργειών του επιλεγμένου στελέχους SP24, καθώς επίσης και η επίδραση της παροχής οξυγόνου στο ρυθμό μικροβιακής αύξησης και της ενζυμικής βιοσύνθεσης. Επιπλέον μελετήθηκε η κυτταρική τοπολογία των ξυλανολυτικών και κυτταρινολυτικών ενζύμων. Αναφορικά με τη βελτιστοποίηση του μέσου αύξησης, η μέγιστη ενζυμική συμπαραγωγή παρατηρήθηκε παρουσία πιτύρου σίτου ως βασική πηγή άνθρακα και συμπληρωματική πηγή την ξυλάνη σημύδας, μειώνοντας το κόστος της διεργασίας. Τα υψηλά επίπεδα αερισμού της καλλιέργειας ήταν καθοριστικός παράγοντας για τον ταχύ μικροβιακό ρυθμό αύξησης και την ενζυμική βιοσύνθεση εκτός από την περίπτωση της β-γλυκοζιδάσης η οποία εμφάνισε αντίθετο πρότυπο παραγωγής. Παράλληλα, οι ξυλανάσες και οι κυτταρινάσες, ένζυμα που δρουν σε μεγαλομοριακά υποστρώματα, εντοπίστηκαν εξ ολοκλήρου εκτός του κυττάρου, ενώ οι β-γλυκοζιδικές ενεργότητες εμφανίστηκαν αρχικά στο κυτταρόπλασμα και μόνο στα τελικά στάδια της ζύμωσης ανιχνεύθηκαν εξωκυτταρικά, γεγονός που σχετίστηκε με την αυτόλυση των κυττάρων κατά τη φάση θανάτου. Συμπερασματικά, οι πληροφορίες από τα ανωτέρω αποτελέσματα επιτρέπουν τη μελλοντική αξιοποίηση του υδρολυτικού δυναμικού του επιλεγμένου μικροοργανισμού σε ευρύτερης κλίμακας ζυμώσεις. Συγχρόνως, ο μοριακός εντοπισμός γονιδίων κυτταρινάσης και ξυλανάσης στο γονιδίωμα του στελέχους SP24 επιτρέπει επίσης την υπερέκφραση αυτών σε μεσόφιλα συστήματα. Το δεύτερο μέρος της παρούσας εργασίας αφορούσε στην εκτίμηση του λιπολυτικού δυναμικού των 101 θερμόφιλων βακτηριακών στελεχών και στην επιλογή ενζύμων (και όχι μικροοργανισμών αυτή τη φορά) με βιοτεχνολογικά αξιοποιήσιμες ιδιότητες για την υπερέκφραση αυτών σε μεσόφιλους δέκτες. Ο προσδιορισμός της λιπολυτικής ικανότητας των θερμόφιλων βακτηρίων πραγματοποιήθηκε τόσο ποιοτικά (στερεές καλλιέργειες) όσο και ποσοτικά (υγρές καλλιέργειες) και επιλέχθηκαν 9 στελέχη (SP14, SP22, SP29, SP73, SP75, SP76, SP79, SP83 και SP93) για την υψηλή υδρολυτική τους δράση. Χαρακτηριστικό ήταν, ότι κανένα επιλεγμένο στέλεχος για την αυξημένη λιπολυτική του ικανότητα δεν εμφάνισε αντίστοιχη κυτταρινολυτική ή ξυλανολυτική δράση. Ακολούθησε φαινοτυπικός και γενετικός χαρακτηρισμός των 9 θερμόφιλων βακτηρίων και μελέτη της βιοσύνθεσης λιπασών σε υγρές και στερεές καλλιέργειες διαφορετικών πηγών άνθρακα. Με δεδομένο ότι τα χαμηλά επίπεδα ενζυμικής παραγωγής δεν επέτρεψαν τον πρωτεϊνικό καθαρισμό από καλλιέργεια των στελεχών φυσικού τύπου, η υπερέκφραση των επιθυμητών γονιδίων σε μεσόφιλα συστήματα ήταν ο επόμενος στόχος. Το γονίδιο λιπάσης που επιλέχθηκε για κλωνοποίηση και υπερέκφραση ήταν το προϊόν ενίσχυσης από το γονιδίωμα του στελέχους SP22 (κωδικός NCBI-JQ808133). Η επιλογή βασίστηκε στην αυξημένη σταθερότητα και θερμική αντοχή καθώς και στην αλκαλοφιλία που επέδειξε η αντίστοιχη λιπάση κατά τη μελέτη των χαρακτηριστικών της συγκριτικά με τις υπόλοιπες 8. Η απομόνωση και ανάλυση της αλληλουχίας του επιλεγμένου γονιδίου εμφάνισε ένα ανοιχτό πλαίσιο ανάγνωσης 1251 ζ.β και η πρωτοταγής δομή της πρωτεΐνης ανέδειξε το χαρακτηριστικό πενταπεπτίδιο Ala-Χ-Ser-Χ-Gly καθώς και τη σημαντική για το ενεργό κέντρο, τριάδα His - 42, Ser -141 και Asp-345. Τα παραπάνω αποτελούν ιδιαιτερότητες των θερμόφιλων λιπασών (υποοικογένεια I.5) του γένους Bacillus. Αρχικά, η υπερέκφραση του γονιδίου της λιπάσης πραγματοποιήθηκε σε βακτηριακό σύστημα (δεκτικά κύτταρα E.coli) υπό τον έλεγχο του ισχυρού υποκινητή Τ7 (φορέας κλωνοποίησης - pET15b). Συνολικά, χρησιμοποιήθηκαν 3 σειρές ξενιστικών κυττάρων (DH5a, BL21(DE3) και BL21(DE3)pLysS) στις οποίες μελετήθηκε η κινητική έκφρασης της θερμοσταθερής λιπάσης. Η υπερέκφραση της θερμοσταθερής λιπάσης του στελέχους SP22 (Geobacillus sp.) σε προκαρυωτικό σύστημα εμφάνισε προβλήματα, καθότι σε συνθήκες υψηλής παραγωγής οδήγησε στον σχηματισμό αδιάλυτων συσσωματωμάτων για τα οποία ενδεχομένως ευθύνονται τα βασικά φυσικοχημικά χαρακτηριστικά του μορίου όπως η υδροφοβικότητα, το υψηλό ισοηλεκτρικό του ή κάποια απαιτούμενη μεταμεταφραστική τροποποίηση. Η ανάγκη εύρεσης ενός πιο αποδοτικού συστήματος υπερέκφρασης της θερμοσταθερής λιπάσης οδήγησε στην επιλογή του flashBAC™. Αξίζει να αναφερθεί ότι το σύστημα αυτό ουδέποτε έχει χρησιμοποιηθεί για την υπερέκφραση βακτηριακής λιπάσης παρά μόνο σε ορισμένες περιπτώσεις ευκαρυωτικών γονιδίων λιπάσης. Επίσης, οι αναφορές έκφρασης θερμοσταθερών πρωτεϊνών μέσω των βακυλοϊών στη διεθνή βιβλιογραφία είναι ελάχιστες και μάλιστα όχι από βακτήρια. Η υπερέκφραση της λιπάσης με το σύστημα flashBAC™ οδήγησε σε εξαιρετικά υψηλές τιμές ειδικής ενζυμικής ενεργότητας καθώς επίσης και στην ολοκληρωτική εμφάνιση της πρωτεΐνης σε διαλυτή μορφή. Αναλυτικότερα, τα επίπεδα ειδικής ενζυμικής ενεργότητας εμφανίστηκαν έως και 10000 φορές υψηλότερα από το στέλεχος φυσικού τύπου και ενισχυμένα κατά 5000 φορές συγκριτικά με το ετερόλογο προκαρυωτικό σύστημα έκφρασης. Ακολούθησε η αριστοποίηση των συνθηκών καλλιέργειας μολυσμένων Sf9 κυττάρων και παραγωγής του ενζύμου και ο καθαρισμός της υπερεκφρασμένης λιπάσης από το εξωκυττάριο υγρό με ένα μόνο χρωματογραφικό βήμα. Η θερμοσταθερή λιπάση παρελήφθη σε ηλεκτροφορητικά καθαρή μορφή (46 kDa) και στη συνέχεια χαρακτηρίστηκε φυσικοχημικά και κινητικά. Εμφάνισε αυξημένη θερμοσταθερότητα έως τους 65 oC (άριστη θερμοκρασία δράσης), σχεδόν χωρίς καμία απώλεια ενεργότητας, και η κινητική θερμικής απενεργοποίησης του ενζύμου ήταν 2 τάξεων. Όσον αφορά στο pH, η λιπάση εμφανίστηκε αρκετά σταθερή σε ένα ευρύ φάσμα τιμών και ως άριστη τιμή δράσης ήταν το 9. Επίσης, το ένζυμο επέδειξε σταθερότητα παρουσία διαφορετικών οργανικών διαλυτών ενώ το ασβέστιο φάνηκε να ενισχύει τη λιπολυτική ενεργότητα. Η εξάρτηση του ενζύμου από το ασβέστιο εμφανίστηκε και στην ολοκληρωτική απώλεια δράσης του παρουσία του χηλικού παράγοντα EDTA (μεταλλοένζυμο). Ολοκληρώνοντας τον χαρακτηρισμό της λιπάσης, μελετήθηκε η δράση της έναντι ψευδοϋποστρωμάτων με λιπαρά οξέα διαφορετικών αλυσίδων. Η λιπάση εμφάνισε μεγαλύτερη συγγένεια με το καπρυλικό οξύ (8 άτομα άνθρακα) και μεγαλύτερη ταχύτητα αντίδρασης στη διάσπαση εστέρων με παλμιτικό οξύ (16 άτομα άνθρακα). Ωστόσο, η μεγαλύτερη αποδοτικότητα του μορίου εντοπίστηκε κατά την υδρόλυση του ψευδοϋποστρώματος με λαυρικό οξύ (12 άτομα άνθρακα). Τέλος, διαπιστώθηκε η ικανότητα της θερμοσταθερής λιπάσης να καταλύει την αντίδραση εστεροποίησης της τυροσόλης παρουσία ιοντικών υγρών. Τα λιπόφιλα παράγωγα της τυροσόλης εμφανίζουν πλήθος εφαρμογών στο πεδίο των φαρμάκων ή των προϊόντων αντιγήρανσης. Η απόδοση της αντίδρασης εστεροποίησης από την υπερεκφρασμένη λιπάση εμφάνισε εξάρτηση τόσο με τη φύση του ιοντικού υγρού όσο και με την κατάσταση του ενζυμικού δείγματος (λυοφιλιωμένο ή ακινητοποιημένη λιπάση σε Celite). Η ακινητοποίηση του ενζύμου σε αδρανή φορέα αύξησε κατά 30 % την απόδοση της βιοκατάλυσης συγκριτικά με το λυοφιλιωμένο ένζυμο και η ικανότητα αυτή είναι ανάλογη με διάφορα εμπορικά σκευάσματα.