Ρύθμιση της έκφρασης και λειτουργία του θερμοεπαγόμενου γονιδίου hsp27 στη μεσογειακή μύγα, Ceratitis capitata

Abstract

AbstractOne widely conserved mechanism of cellular response to heat shock and other stressors, is the rapid and massive synthesis of heat shock proteins (Hsps) (reviewed by Morimoto et al., 1994). Hsps are molecular chaperones that confer proper protein folding and play important functions in stress response, by preventing the accumulation of damaged or misfolded proteins in cells (reviewed by Hartl and Hayer-Hartl, 2002). Hsps are grouped in distinct families according to their molecular weights. The superfamily of small heat shock proteins (sHsps)-a crystalin includes proteins, varying greatly in amino acid sequence and size (12 to 43 kDa). The majority of sHsps share common features such as, an evolutionary conserved C-terminal a-crystalin domain of about 80–100 amino acid residues and the formation of oligomeric complexes up to 800 kDa (reviewed by de Jong et al., 1998, MacRae, 2000, Nakamoto and Vígh, 2007). In addition to their roles in protecting cells from stress, they are involved in many cellular functions (reviewed by Arrigo, 1998, MacRae, 2000, Mounier and Arrigo, 2002, Arrigo, 2005, Garrido et al., 2012). Several studies have shown the involvement of certain sHsps in human diseases (reviewed by Boncoraglio et al., 2012, Kampinga and Garrido, 2012, Bakthisaran et al., 2015). One of the well-studied sHsps is Hsp27. In addition to its role as molecular chaperone, Hsp27 has been reported to be involved in many cellular functions, such as cytoskeleton stabilization, actin polymerization, cell death, development and differentiation, (reviewed by Arrigo et al., 2007, Lomiwes et al., 2014) as well as in pathological conditions (Kato et al., 1994, Plumier et al., 1997a, Currie et al., 2000, reviewed by Arrigo et al., 2007).Functional analysis of the 5΄ upstream region of the hsp27 gene of the Mediterranean fruit fly, Ceratitis capitata (medfly) (Cchsp27) was performed by creating transgenic strains, in order to identify and to determine the role of the elements that regulate the expression of the gene. The transposable genetic element piggyBac was used for the genetic transformation of the medfly (Handler et al., 1998). Transgenic strains were generated including the luciferase reporter gene under the control of various sequences of the 5΄ upstream region of the gene. The results from the analysis showed that the region (-2808/+150) of the gene and the lower region (-1378/+150), which contain five potentially heat shock elements (HSEs), gave the greater heat induction. These results suggest that the five HSEs which have been identified in the region -1378/+150, are capable of a maximum heat induction of the gene. According to the results, in the -2808/-1378 region of the gene, there are no other elements taking part in gene regulation by heat induction. The results from the region (-1122/+150) including the first three HSEs indicated lower heat shock expression levels from the region (-1378/+150), while the region (-934/+150), which includes only the first two HSEs, gave about the same heat shock expression levels with the region (-1378 /+150). The results from the analysis showed that the contribution of the third HSE might not be significant to heat shock expression of the gene. The analysis from the region (-509/+150), where there are no HSEs, gave significant levels of heat shock expression of the gene. This fact, combined with bioinformatics analysis revealed the existence of two other potential HSEs (a and b). In addition, the levels of luciferase in the above transgenic strains were measured in order to identify the regulatory elements involved in the induction of Cchsp27 gene from cold stress. The results from the analysis were similar to those observed after heat stress. This suggests that the same regulatory elements (HSEs) induce Cchsp27 gene in both high and low temperatures.The levels of luciferase in the ovaries of the above transgenic strains were measured, under normal conditions, in order to identify the regulatory elements involved in the expression of Cchsp27 gene in ovaries. The analysis showed that the 5΄ upstream region (-1378/-1122) contains elements that enchance the expression of the gene, while the region (-2808/-1378) of the gene appears to contain one or more regulatory elements that suppress its expression. The expression of Cchsp27 gene, in both mRNA and protein level, revealed that it is highly variable during development of the insect, under normal conditions. The results suggest that Hsp27, except from its role as a molecular chaperone, has an important role in other functions during the development of insects. The cell-specific expression and intracellular distribution of the Hsp27 was investigated in all tissues of the medfly. For this study, a Cchsp27-gfp transgenic strain was used to detect the chimeric protein by confocal microscopy. The results from the expression of Hsp27 in various tissues of the medfly indicate that, the protein shows highest expression in larval tissues than in adult tissues, under normal conditions. After heat stress, protein expression is high in both larval and adult tissues. Under normal conditions, the protein is identified both in the nucleus and in the cytoplasm in some tissues such as, the cuticle of pupa, the salivary glands, the ring gland of the larval central nervous system and certain types of neurons of the adult central nervous system. In the other tissues and systems (digestive truct, malpighian tubules, salivary glands, fat body, flight muscles, respiratory system, embryonic discs, embryo), the protein Hsp27 is localized only in the nucleus, under both normal and heat shock conditions. These results, combined with studies in Drosophila melanogaster (Michaud et al., 2008) where Hsp27 is detected in nuclear granules (nuclear speckles), suggest that one role of the CcHsp27 could be the stabilization of nuclear complexes in the nucleus.In unstressed ovaries, the protein was expressed throughout egg development in a stage and cell-specific pattern. In germarium, the protein was detected in the cytoplasm of the somatic cells in both unstressed and heat-shocked ovaries. In the early stages of oogenesis of unstressed ovaries, the protein was mainly located in the perinuclear region of the germ cells and in the cytoplasm of the follicle cells, while in later stages (9–10) it was distributed in the cytoplasm of the germ cells. In late stages (12–14), the protein changed localization pattern and was exclusively associated with the nuclei of the somatic cells. In heat shocked ovaries, the protein was mainly located in the nuclei of the somatic cells throughout egg chamber’s development. In unstressed testes, the chimeric protein was detected in the nuclei of primary spermatocytes and in the filamentous structures of spermatid bundles, called actin cones. Interestingly, after a heat shock, the protein presented the same cell-specific localization pattern as in unstressed testes. Furthermore, the protein was also detected in the nuclei of the epithelial cells of the deferent duct, the accessory glands and the ejaculatory bulb. According to other reports, these data suggest that medfly Hsp27 may have cell-specific functions, especially in the nucleus, indicating a possible role of the CcHsp27 in the stabilization of nuclear complexes and the formation and stabilization of actin cones.

ΠερίληψηΈνας συντηρημένος μηχανισμός κυτταρικής απόκρισης στο θερμικό και άλλα είδη στρες είναι η σύνθεση των θερμοεπαγόμενων πρωτεϊνών (Hsps) (reviewed by Morimoto et al., 1994). Οι Hsps αποτελούν μοριακούς συνοδούς, με κύριο ρόλο την πρόσδεσή τους σε μερικώς αποδιαταγμένες πρωτεΐνες εμποδίζοντας έτσι την συσσωμάτωσή τους (reviewed by Hartl and Hayer-Hartl, 2002). Οι Hsps κατηγοριοποιούνται σε διακριτές οικογένειες σύμφωνα με τα μοριακά τους βάρη. Η υπεροικογένεια των μικρών θερμοεπαγόμενων πρωτεϊνών (sHsps)-α κρυσταλλίνης, περιλαμβάνει πρωτεΐνες με μοριακό βάρος που ποικίλει μεταξύ 12-43 kDa. Κύρια χαρακτηριστικά τους είναι η ύπαρξη μιας πολύ συντηρημένης επικράτειας της α-κρυσταλλίνης στο καρβoξυτελικό τους άκρο, περίπου 80-100 αμινοξικών καταλοίπων και η ικανότητά τους να δημιουργούν δυναμικά ολιγομερή, πάνω από 800 kDa (reviewed by de Jong et al., 1998, MacRae, 2000, Nakamoto and Vígh, 2007). Εκτός από τον ρόλο τους στην προστασία των κυττάρων σε καταστάσεις στρες, συμμετέχουν και σε μια πλειάδα άλλων κυτταρικών λειτουργιών (reviewed by Arrigo, 1998, MacRae, 2000, Mounier and Arrigo, 2002, Arrigo, 2005, Garrido et al., 2012). Επίσης, πολλές μελέτες επισημαίνουν τη συμμετοχή των sHsps σε ανθρώπινες ασθένειες (reviewed by Boncoraglio et al., 2012, Kampinga and Garrido, 2012, Bakthisaran et al., 2015). Μία από τις πιο καλά μελετημένες sHsps είναι η Hsp27. Η Hsp27, εκτός από τον κύριο ρόλο της ως μοριακός συνοδός, εμπλέκεται και σε άλλες κυτταρικές λειτουργίες όπως η σταθεροποίηση του κυτταροσκελετού, ο πολυμερισμός της ακτίνης, η ανάπτυξη και διαφοροποίηση των κυττάρων και ο κυτταρικός θάνατος (reviewed by Arrigo et al., 2007, Lomiwes et al., 2014) καθώς και σε παθολογικές καταστάσεις (Kato et al., 1994, Plumier et al.,1997a, Currie et al., 2000, reviewed by Arrigo et al., 2007). Προκειμένου να γίνει ταυτοποίηση και να προσδιοριστεί ο ρόλος των στοιχείων που ρυθμίζουν την έκφραση του γονιδίου hsp27 της Μεσογειακής μύγας (Cchsp27) πραγματοποιήθηκε λειτουργική ανάλυση της 5΄ ανοδικής περιοχής του γονιδίου μέσω δημιουργίας διαγονιδιακών στελεχών. Για το γενετικό μετασχηματισμό της Μεσογειακής μύγας χρησιμοποιήθηκε το μεταθέσιμο γενετικό στοιχείο piggyΒac (Handler et al., 1998). Τα διαγονιδιακά στελέχη που δημιουργήθηκαν έφεραν το γονίδιο αναφοράς της λουσιφεράσης υπό τον έλεγχο διαφόρων αλληλουχιών της 5΄ ανοδικής περιοχής του γονιδίου. Τα αποτελέσματα των αναλύσεων έδειξαν πως η ευρύτερη 5΄ανοδική περιοχή του γονιδίου (-2808/+150) καθώς και η μικρότερη περιοχή (-1378/+150), οι οποίες περιέχουν και τα πέντε δυνητικά στοιχεία απόκρισης στη θερμότητα (HSEs), δίνουν την μεγαλύτερη θερμοεπαγωγή. Τα αποτελέσματα αυτά υποδηλώνουν πως τα πέντε HSEs που έχουν ταυτοποιηθεί στην περιοχή -1378/+150, είναι ικανά για μέγιστη θερμοεπαγωγή του γονιδίου. Επίσης, φαίνεται πως δεν υπάρχουν στην -2808/-1378 περιοχή άλλα στοιχεία που να παίζουν ρόλο στη ρύθμιση του γονιδίου από τη θερμότητα. Η περιοχή (-1122/+150) που περιλαμβάνει τα τρία πρώτα HSEs έδωσε χαμηλότερα θερμοεπαγόμενα επίπεδα έκφρασης από την περιοχή (-1378/+150), ενώ η περιοχή (-934/+150), που περιλαμβάνει μόνο τα δύο πρώτα HSEs, έδωσε περίπου ίδια θερμοεπαγόμενα επίπεδα έκφρασης με την περιοχή (-1378/+150) γεγονός που υποδηλώνει ότι το τρίτο HSE δεν φαίνεται να συμβάλει σημαντικά στη θερμοεπαγόμενη έκφραση του γονιδίου. Η περιοχή (-509/+150) που δεν περιλαμβάνει κανένα από τα πέντε HSEs του γονιδίου, έδωσε εντούτοις σημαντικά επίπεδα θερμοεπαγόμενης έκφρασης. Το γεγονός αυτό σε συνδυασμό με βιοπληροφορική ανάλυση αποκάλυψε την ύπαρξη άλλων δύο δυνητικών HSEs (α και β). Για να προσδιοριστούν τα ρυθμιστικά στοιχεία που ενέχονται στη επαγωγή του Cchsp27 γονιδίου από το ψυχρό στρες, μετρήθηκαν τα επίπεδα της λουσιφεράσης στα παραπάνω διαγονιδιακά στελέχη. Tα αποτελέσματα που πήραμε ήταν παρόμοια με εκείνα μετά από θερμικό στρες. Το γεγονός αυτό υποδηλώνει πως τα ίδια ρυθμιστικά στοιχεία (HSEs) επάγουν το γονίδιο τόσο στις υψηλές όσο και στις χαμηλές θερμοκρασίες.Προκειμένου να δούμε εάν υπάρχουν αλληλουχίες της 5΄ περιοχής του Cchsp27 γονιδίου που παίζουν κάποιο ρόλο στην έκφρασή του γονιδίου στις ωοθήκες σε φυσιολογικές συνθήκες, προσδιορίστηκε η ενεργότητα της λουσιφεράσης στις ωοθήκες των διαγονιδιακών στελεχών. Η ανάλυση έδειξε πως η 5΄ ανοδική περιοχή (-1378/-1122) περιέχει ενυσχητικά στοιχεία που επάγουν την έκφραση του γονιδίου, ενώ η περιοχή (-2808/-1378) του γονιδίου φαίνεται να περιέχει ένα ή περισσότερα ρυθμιστικά στοιχεία που καταστέλλουν την έκφρασή του.Σε φυσιολογικές συνθήκες, η έκφραση του γονιδίου Cchsp27, τόσο στο επίπεδο του mRNA όσο και στο επίπεδο της πρωτεΐνης, παρουσιάζει έντονες διακυμάνσεις κατά την ανάπτυξη του εντόμου, υποδηλώνοντας ότι η Ηsp27, εκτός από το ρόλο της ως μοριακού συνοδού, θα πρέπει να συνδέεται και με άλλες λειτουργίες κατά την ανάπτυξη των εντόμων.Προκειμένου να μελετηθεί η έκφραση της πρωτεΐνης Hsp27 στους ιστούς της Μεσογειακής μύγας, δημιουργήθηκε το διαγονιδιακό στέλεχος Cchsp27-gfp και η μελέτη έγινε με πειράματα συνεστιακής μικροσκοπίας φθορισμού. Τα αποτελέσματα από την έκφραση της Hsp27 στους διάφορους ιστούς της Mεσογειακής μύγας, δείχνουν ότι, σε φυσιολογικές συνθήκες, η πρωτεΐνη παρουσιάζει υψηλότερη έκφραση στους προνυμφικούς ιστούς από ότι στους ενήλικους ιστούς. Μετά από θερμικό στρες, η έκφραση της πρωτεΐνης είναι υψηλή τόσο στους προνυμφικούς όσο και στους ενήλικους ιστούς. Με εξαίρεση την επιδερμίδα της νύμφης, τους σιελογόνους αδένες της προνύμφης, τον δακτυλιοειδή αδένα του κεντρικού νευρικού συστήματος της προνύμφης και ορισμένους τύπους νευρώνων του κεντρικού νευρικού συστήματος του ενήλικου εντόμου, όπου η πρωτεΐνη εντοπίζεται και στον πυρήνα και στο κυτταρόπλασμα σε φυσιολογικές συνθήκες, σε όλους τους άλλους ιστούς και συστήματα (πεπτικό σύστημα, μαλπιγγιανά σωληνάρια, σιελογόνοι αδένες, λιπώδης ιστός, θωρακικοί μύες, αναπνευστικό σύστημα, εμβρυϊκοί δίσκοι, έμβρυο), η πρωτεΐνη εντοπίζεται μόνο στον πυρήνα, τόσο απουσία όσο και παρουσία θερμικού στρες. Τα αποτελέσματα αυτά, σε συνδυασμό με μελέτες στο έντομο Drosophila melanogaster (Michaud et al., 2008) όπου η Hsp27 έχει εντοπιστεί στα πυρηνικά κοκκία (nuclear speckles), μας επιτρέπει να υποθέσουμε πως ένας ρόλος της CcHsp27 στους πυρήνες θα μπορούσε να είναι η σταθεροποίηση των πυρηνικών συμπλόκων όπως αναφέρεται και παρακάτω.Κατά την ωογένεση, η πρωτεΐνη Hsp27 εκφράζεται σε όλα τα αναπτυξιακά στάδια με στάδιο-ειδικό και κύτταρο-ειδικό τρόπο. Στο γερμάριο, η πρωτεΐνη βρίσκεται στο κυτταρόπλασμα των σωματικών κυττάρων, σε φυσιολογικές συνθήκες αλλά και μετά από θερμικό στρες. Σε φυσιολογικές συνθήκες, στα πρώιμα στάδια της ωογένεσης, η πρωτεΐνη εντοπίζεται στην περιπυρηνική περιοχή των γεννητικών κυττάρων και στο κυτταρόπλασμα των επιθηλιακών κυττάρων, ενώ στα στάδια (9-10) εντοπίζεται στο κυτταρόπλασμα των γεννητικών κυττάρων. Στα πιο ώριμα στάδια (12-14) η πρωτεΐνη αλλάζει πρότυπο έκφρασης και εντοπίζεται στον πυρήνα των σωματικών κυττάρων. Μετά από θερμικό στρες, η πρωτεΐνη εντοπίζεται κυρίως στον πυρήνα των σωματικών κυττάρων σ’ όλη τη διάρκεια της ωογένεσης. Στη σπερματογένεση, σε φυσιολογικές συνθήκες, η πρωτεΐνη εντοπίζεται στον πυρήνα των πρόδρομων σπερματοκυττάρων και στους κώνους ακτίνης οι οποίοι βοηθούν στο διαχωρισμό των σπερματίδων. Μετά από θερμικό στρες, η πρωτεΐνη παρουσιάζει τον ίδιο κυτταρο-ειδικό εντοπισμό, ενώ εντοπίζεται επίσης και στους πυρήνες των επιθηλιακών κυττάρων των φερόντων αγωγών, των μακρών και βραχέων βοηθητικών αδένων και του βολβού εκσπερμάτισης. Τα αποτελέσματα της διατριβής αυτής, σε συνδυασμό με αποτελέσματα άλλων ερευνητών προτείνουν πως η Hsp27 της Μεσογειακής μύγας θα πρέπει να έχει σημαντική κυτταρο-ειδική λειτουργία, ειδικά στον πυρήνα των κυττάρων, συμβάλλοντας στη σταθερότητα και προστασία των πυρηνικών συμπλόκων αλλά και στη δυναμική και προστασία των ινιδίων της ακτίνης.