Παραγωγή και μελέτη συστήματος θερμοανθεκτικών ημικυτταρινασών

Abstract

In the present Thesis, the hemicellulolytic system of the thermophilic fungi Chaetomium thermophilum IMI 291753, Thermomyces lanuginosus IMI 84400 and Sporotrichum thermophile ATCC 34628 was studied with regard to the optimization and characterization of xylanase production. Subsequently, the isolation, purification and characterization of β-xylosidase and endoxylanase from S. thermophile ATCC 34628 were accomplished. The optimization of xylanase production was based on a 32 central composite experimental design. The parameters studied were carbon and nitrogen sources. A second-order quadratic model and a response surface methodology were used to predict the optimum conditions for xylanase production. The results obtained here were confirmed by the experimental results that followed. In all cases, the raw materials for optimization trials were agro-industrial by-products of low cost, such as corn cob and wheat straw. The xylanase production optimization was followed by their characterization concerning thermostability and pH optimum. The characteristics of xylanases from all three fungi were proved to be hopeful for potential industrial applications. The ability of the enzyme produced by C. thermophilum IMI 291753 to be active in high pH values could be very useful for the treatment of alkaline pulps. Thermostable cellulase-free xylanase was produced by T. lanuginosus IMI 84400. The xylanase production was comparable to the production reported for other xylanase hyperproducing microorganisms and for different strains of the same microorganism, as well. Taking into account that low cost industrial wastes have been used as raw materials, the production of this xylanase would decrease the cost of production in an environmentally sound manner. Finally, two of the hemicellulolytic enzymes from S. thermophile ATCC 34628 were purified and characterized during this study: An extracellular endoxylanase and an intracellular β-xylosidase. The characterization of the two enzymes was made with regard to the molecular weight, thermostability, pH optimum, pI, specificity and inhibition. Based on the catalytic properties and the partial subsite mapping, the endo-xylanase purified from S. thermophile ATCC 34628 can be classified in family 11 of glycosyl hydrolases.

Στην παρούσα διατριβή μελετάται το σύστημα ημικυτταρινασών από τους θερμόφιλους μύκητες Chaetomium thermophilum IMI 291753, Thermomyces lanuginosus IMI 84400 και Sporotrichum thermophile ATCC 34628. Η μελέτη περιλαμβάνει αρχικά την αριστοποίηση της παραγωγής και τον χαρακτηρισμό των ξυλανασών και στη συνέχεια, την απομόνωση και τον καθαρισμό μίας εξ’ αυτών καθώς και μιας β-ξυλοζιδάσης από τον S. thermophile ATCC 34628. Για την αριστοποίηση της παραγωγής των ξυλανασών από τους θερμόφιλους μύκητες C. thermophilum IMI 291753, T. lanuginosus IMI 84400 και S. thermophile ATCC 34628, κατά τη διάρκεια της καλλιέργειάς τους σε βυθισμένη καλλιέργεια χρησιμοποιήθηκε κεντρικός σχεδιασμός αστέρα 32. Οι αρχικές παράμετροι που μελετήθηκαν ήταν οι πηγές άνθρακα και αζώτου. Τα αποτελέσματα χρησιμοποιήθηκαν για την κατασκευή δευτεροβάθμιων γραμμικών μοντέλων. Μέσω αυτών των μοντέλων έγινε η πρόβλεψη των βέλτιστων συνθηκών για την παραγωγή των ξυλανασών με τη μέθοδο της επιφανειακής απόκρισης. Για κάθε μοντέλο το θεωρητικό βέλτιστο επαληθεύτηκε πειραματικά με πολύ ικανοποιητική προσέγγιση. Σε όλες τις περιπτώσεις, η παραγωγή των ημικυτταρινασών από τους τρεις μύκητες πραγματοποιήθηκε από αγροτοβιομηχανικά παραπροϊόντα, δηλαδή από εξαιρετικά φθηνές πρώτες ύλες όπως ο σπάδικας αραβοσίτου και το άχυρο σίτου. Την αριστοποίηση των συνθηκών παραγωγής των ξυλανασών ακολούθησε ο χαρακτηρισμός τους αναφορικά με την θερμοσταθερότητά τους και το βέλτιστο pH δράσης τους. Οι ξυλανάσες των τριών μικροοργανισμών παρουσίασαν χαρακτηριστικά ελπιδοφόρα για την βιομηχανική παραγωγή και εκμετάλλευσή τους. Η ικανότητα του ενζύμου από τον C. thermophilum IMI 291753 να δρα σε αλκαλικό pH, θα μπορούσε να βρει εφαρμογή στην κατεργασία αλκαλικών πολτών στη χαρτοβιομηχανία. Οι θερμοάντοχες ξυλανάσες, ελεύθερες κυτταρινασών, παράγονται από τον T. lanuginosus IMI 84400 σε παραγωγή συγκρίσιμη με την παραγωγή τους τόσο από άλλα στελέχη του ίδιου μικροοργανισμού, όσο και από άλλους υπερθερμόφιλους μικροοργανισμούς. Το γεγονός αυτό σε συνδυασμό με τις φθηνές πρώτες ύλες θα μπορούσε να συμβάλλει στη μείωση του κόστους της βιομηχανικής τους παραγωγής με φιλικό προς το περιβάλλον τρόπο. Τέλος, στα πλαίσια αυτής της διατριβής, πραγματοποιήθηκε η απομόνωση, ο χαρακτηρισμός και η μελέτη δύο ημικυτταρινολυτικών ενζύμων του S. thermophile ATCC 34628, μίας ενδοξυλανάσης και μίας β-ξυλοζιδάσης. Τα δύο ένζυμα μελετήθηκαν αναφορικά με το μοριακό τους βάρος, τη θερμοανθεκτικότητά τους, το βέλτιστο pH, το ισοηλεκτρικό τους σημείο, την εξειδίκευσή τους και τους αναστολείς τους. Τα αποτελέσματα της μελέτης για την απομονωμένη ενδοξυλανάση δείχνουν ότι το ένζυμο αυτό έχει παρόμοιες καταλυτικές ιδιότητες με ένζυμα που ανήκουν στην οικογένεια 11 των γλυκοϋδρολασών.